李 宇，劉海華，劉翠君，由金文，趙仁君，石愛華，何美軍 *

（1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2. 恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

0 引言

【研究意義】抗生素濫用導(dǎo)致大量耐藥菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌等病原菌出現(xiàn)，極大威脅人類健康。有文獻(xiàn)報道全球每年約70萬人死于耐藥菌感染，預(yù)計(jì)到2050年死亡人數(shù)可達(dá)到1000萬，僅在美國死于MRSA感染的人數(shù)就超過艾滋病和結(jié)核病的總和[1,2]?？股啬退幮詥栴}已成為威脅全球人類健康的緊迫問題，新型抗生素研發(fā)迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】老鸛草（Geranium wilfordii Maxim）是老鸛草屬（Geranium）植物，味辛、苦；性平；有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止瀉痢的功效；用于風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣、筋骨酸痛、泄瀉痢疾等癥[3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)老鸛草具有消炎抗氧化、降糖保肝等多種生理功能。鼠掌老鸛草（Geranium sibiricumL.）水煎液對經(jīng)番瀉葉水煎液處理的小鼠有止瀉作用，對正常小鼠小腸運(yùn)動有抑制作用，對推進(jìn)機(jī)能亢進(jìn)的小鼠小腸運(yùn)動也有抑制作用[4]。老鸛草提取物可顯著降低大鼠幽門結(jié)扎型、乙酸灼傷型、乙醇及吲哚鎂辛誘導(dǎo)型的胃潰瘍，能抑制幽門結(jié)扎型胃潰瘍大鼠胃酸分泌、抑制胃蛋白酶活性[5]。野老鸛草（Geranium carolinianumL.）水浸提取液對玉米、花生和大豆都具有化感作用，其中對玉米的化感作用最大[6]。為進(jìn)一步研究老鸛草的生理活性，已有學(xué)者從老鸛草中分離鑒定了13個具有多種生理活性的次級代謝產(chǎn) 物：β-谷 甾 醇、1,2,3,6-四-O-沒 食 子 酰-β-D-葡 萄糖、短葉蘇木酚羧酸、原兒茶酸、沒食子酸、對羥基苯甲酸、胡蘿卜苷、槲皮素、1,3,6-三-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖、老鸛草素和corilogin[7?10]。XU等[11]研究發(fā)現(xiàn)corilagin通過激活caspase-8、caspase-9、caspase-3和poly ADP-ribose聚合酶蛋白誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，corilagin能通過誘發(fā)胃癌細(xì)胞自噬（autophagy）和增加細(xì)胞活性氧（ROS）等方式抑制胃癌細(xì)胞生長。老鸛草素具有抗病毒、抗高血壓、抗高血糖、保護(hù)肝臟、抗糖尿病和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種生物活性，老鸛草素能通過抑制FAK/Src、ERK1/2途徑衰減MMP-2的表達(dá)和活性，抑制口腔癌細(xì)胞SCC-9和SCC-14的遷移和入侵[12]。【本研究切入點(diǎn)】目前尚無文獻(xiàn)報道老鸛草乙醇提取物對臨床常見致病菌的抑菌活性、抑菌機(jī)理，以及老鸛草乙醇提取物的揮發(fā)組分、黃酮類化合物種類?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬鑒定恩施產(chǎn)區(qū)老鸛草乙醇提取物的揮發(fā)性組分和黃酮類化合物種類；檢測恩施產(chǎn)區(qū)老鸛草乙醇提取物對12株臨床致病菌肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌、大腸桿菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度（MIC）值，以期為新型抗生素的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

老鸛草樣品采集于湖北省恩施市華中藥用植物園，經(jīng)緯度坐標(biāo)為109°45′24″ E，30°10′51″ N，經(jīng)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所高級農(nóng)藝師由金文鑒定為老鸛草（G. wilfordii）。老鸛草是全草入藥，所以本研究以老鸛草全草為研究對象。12株臨床致病菌為：肺炎克雷伯（Klebsiella pneumoniaATCC 13883）、糞鏈球菌（Enterococcus faecalisATCC 29212）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcusaureus）、多耐銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、溶 藻 弧 菌（Vibrio alginolyticus XSBZ14）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus epidermidis）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanniiATCC 19606）、大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 29213），由中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定提供。Agilent 1260高效液相色譜儀（配DAD檢測器），Phenomenex 色 譜 柱（50 mm × 4.6 mm, ODS 5 μm），imark酶標(biāo)儀（Bio-Rad美國伯樂），Thermo Fisher世爾電導(dǎo)儀（型號：3-star），aglient Technologies 7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀，RE-200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州市星爍儀器有限公司），黃酮標(biāo)準(zhǔn)品楊梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖均購自阿拉丁試劑公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基配制：酵母提取物5 g·L?1，胰蛋白胨10 g·L?1，NaCl 10 g·L?1，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min（固體LB培養(yǎng)基加入瓊脂20 g·L?1）。

MH液體培養(yǎng)基配制：牛肉粉2 g·L?1，可溶性淀粉1.5 g·L?1，酸水解酪蛋白 17.5 g·L?1，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 老鸛草乙醇提取物獲得 10 g新鮮老鸛草樣品粉碎，為充分提取鞣質(zhì)和黃酮類化合物，以60%乙醇溶液為提取溶劑[13]。料液比1∶50，250 mL乙醇溶液（60%）浸泡18 h，200 w超聲浸提30 min。10 000r·min?1離心取上清，減壓蒸餾得浸膏1.862 g，浸膏得率18.62%。

1.2.2 老鸛草乙醇提取物揮發(fā)性成分與黃酮化合物檢測 氣相色譜條件：agilent 19091S-433毛細(xì)管柱（HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm）；升溫程序：60 ℃保持2 min，5 ℃·min?1升至240 ℃，保持2 min，然后10 ℃·min?1升至280 ℃保持2 min，總運(yùn)行時間23 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣（99.999%）；流速為1.8 mL·min?1；進(jìn)樣量為5 μL不分流。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子能量70 ev，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～500 amu。檢索譜庫為NIST08.LIB標(biāo)準(zhǔn)譜庫，匹配度≥900，鑒定為同一個化合物，運(yùn)用面積歸一化法計(jì)算老鸛草乙醇提取物各組分相對含量[14]。樣品處理：老鸛草乙醇提取物用甲醇溶解，13 000 r·min?1離心10 min，吸取上清進(jìn)樣分析，以分析純甲醇進(jìn)樣作空白對照組，每組樣品重復(fù)進(jìn)樣3次。

高效液相色譜進(jìn)樣條件：時間0 ～20 min，A相95%～20%；時間20 ～25 min，A相20%～0%；時間25～27 min，A相0%～0%；時間27.1 ～30 min，A相95%～95%。A相：95%H2O、5%甲醇、0.1%乙酸，B相：100%甲醇、0.1%乙酸。老鸛草乙醇提取物用甲醇溶解，13 000 r·min?1離心10 min，吸取上清進(jìn)樣分析，以分析純甲醇進(jìn)樣作空白對照組，每組樣品重復(fù)進(jìn)樣3次。利用HPLC外標(biāo)法[15]測定老鸛草乙醇提取物各黃酮組分含量，將3個標(biāo)準(zhǔn)品楊梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖配制成6個質(zhì)量濃度梯度（1.0、2.0 、4.0 、8.0 、16.0 、32.0 μg·mL?1）的混標(biāo)，測定儀器信噪比（S/N），當(dāng)各標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至信噪比3＜S/N＜10時，以該溶液濃度計(jì)算儀器檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），得到3個標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、R2、檢出限和定量限。對各標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每個混標(biāo)重復(fù)檢測6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）。檢測加入標(biāo)量的各樣品的黃酮組分含量，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，重復(fù)檢測6次。外標(biāo)法檢測老鸛草乙醇提取物中各黃酮組分的含量計(jì)算公式：

C：老鸛草樣品中黃酮組分含量；n：HPLC檢測濃度；m：老鸛草樣品干重

1.2.3 老鸛草乙醇提取物抗菌活性測試 用濾紙片法[16]測試?yán)消X草乙醇提取物對12株臨床致病菌的抑菌活性，取20 μL培養(yǎng)至OD600為0.6的測試菌菌液與20 mL LB固體培養(yǎng)基混合均勻倒平板。取5 μL老鸛草乙醇提取物（二甲基亞砜DMSO溶解）于濾紙片上，使濾紙片完全吸收，將濾紙片置于混有菌液的培養(yǎng)基上，另設(shè)氨芐青霉素（100 mg·mL?1）作陽性對照、DMSO作陰性對照，37 ℃培養(yǎng)12 h，測抑菌圈。37 ℃培養(yǎng)12 h，測抑菌圈。參照抗生素藥敏標(biāo)準(zhǔn)：高敏（抑菌圈直徑＞16 mm）、中敏（10～16 mm）、輕敏或耐藥（＜10 mm）。采用微量肉湯稀釋法測定老鸛草乙醇提取物對致病菌的MIC值，按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）M07-A9[17]的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，在12列8行規(guī)格的96孔板上依次添加以下內(nèi)容：第3～12列的每孔加入含乙醇提取物樣品的MH液體培養(yǎng)基100 μL，設(shè)置乙醇提取物終質(zhì)量濃度分別為128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg·mL?1。第1列加入200 μL MH液體培養(yǎng)基， 第2列加入100 μL MH液體培養(yǎng)基（陽性生長組），將培養(yǎng)好的菌液稀釋1000倍， 2～12每孔加入稀釋菌液100 μL。另設(shè)氨芐青霉素（100 mg·mL?1）作藥物陽性對照組。37 ℃培養(yǎng)16 h后使用imark酶標(biāo)儀檢測OD600，根據(jù)CLSI M100-S26[18]標(biāo)準(zhǔn)：與陽性生長對照管比較抑制80%細(xì)菌生長的藥物濃度為受試菌的MIC值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 老鸛草乙醇提取物分揮發(fā)性成分鑒定與相對含量測定

通過GC-MS分析共從老鸛草乙醇提取物中檢測到223個離子峰，通過NIST08.LIB標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，共從老鸛草乙醇提取物中鑒定出18個揮發(fā)性物質(zhì)（表1），主要為脂肪烴（5.72%）、脂肪酸（17.09%）、生物堿（1.15%）。脂肪烴類化合物有6-methyloctadecane（0.56%）、2,6,10-trimethyltetradecane （0.62%）、octadecane （0.97%）、octacosane （1.85%）、（E）-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-en-1-ol （1.50%）、2-methylhexadecan-1-ol （0.52%）、10-octylnonadecane （0.32%）共8個（表1）。脂肪酸類化合物有docosyl docosanoate（0.42%）、methyl 11-（3-pentyloxiran-2-yl） undecanoate（0.96%）、（Z）-7-methyltetradec-8-en-1-yl acetate（0.92%）、methyl palmitate （7.91%）、palmitic acid（0.45%）、methyl （E）-octadec-9-enoate （4.93%）、methyl 12-methyltetradecanoate （0.53%）、oleic acid（0.97%）共8個，其中化合物methyl （E）-octadec-9-enoate、methyl （E）-octadec-9-enoate、oleic acid為不飽和脂肪酸（表1），飽和脂肪酸類化合物具有供應(yīng)能量、增加膽固醇濃度及調(diào)節(jié)低密度脂蛋白（LDL）代謝等多種生理功能，不飽和脂肪酸類化合物具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、降低血壓、抗腫瘤、保護(hù)視力等多種生理功能[19]。

表 1 老鸛草乙醇提取物組分揮發(fā)性成分及其含量測定結(jié)果Table 1 Volatiles in G. wilfordii ethanol-extract

（5.β.）Pregnane-3,20.β.-diol,14.α.,18.α.-[4-methyl-3-oxo-（1-oxa-4-azabutane-1,4-diyl）]-, diacetate （1.15%）是首次在老鸛草乙醇提取物中鑒定的揮發(fā)性生物堿，生物堿具有抗腫瘤、消炎、抗病毒、抗血小板凝集、抗心律失常及抗高血壓等重要生理功能[20]。

2.2 老鸛草乙醇提取物黃酮化合物鑒定與含量測定

通過HPLC檢測得到黃酮標(biāo)準(zhǔn)品楊梅苷（Rt 16.498 min）、花旗松素（Rt 17.508 min）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（Rt 17.978 min）與老鸛草乙醇提取物中3個吸收峰（1） Rt 16.506 min、（2） Rt 17.503 min、（3） Rt 17.981 min保留時間一致（圖1）。

黃酮標(biāo)準(zhǔn)品楊梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖與老鸛草乙醇提取物中3個吸收峰（1、2、3）的吸收光譜分別對應(yīng)一致（圖2），通過保留時間和吸收光譜數(shù)據(jù)鑒定這3個吸收峰分別為楊梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖。

HPLC外標(biāo)法測量3個標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性、檢出限、定量限如表2所示，線性相關(guān)性好（R2≥0.999 0）。通過配制本底含量標(biāo)準(zhǔn)品濃度溶液，加入定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC檢測，獲得標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率為98.56%～101.05%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.55%～1.50%（表2）。

利用HPLC外標(biāo)法檢測老鸛草乙醇提取物各黃酮化合物含量：花旗松素（3.72 mg·g?1）、楊梅苷（2.56 mg·g?1）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（5.56 mg·g?1），加標(biāo)回收率為99.24%～101.98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%～1.12%（表3）。

圖 1 老鸛草乙醇提取物與黃酮標(biāo)準(zhǔn)品保留時間對比Fig. 1 Retention times of G. wilfordii ethanol-extract and flavonoid standards

圖 2 老鸛草乙醇提取物與黃酮標(biāo)準(zhǔn)品光譜對比Fig. 2 Spectrograms on G. wilfordii ethanol-extract and flavonoid standards

表 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性及檢測限（means±SD，n=6）Table 2 Regression equation, correlation coefficient, and detection limit on measurements (means±SD, n=6)

2.3 老鸛草乙醇提取物抗菌活性粗篩

濾紙片活性測試結(jié)果顯示老鸛草乙醇提取物對12株臨床致病菌具有良好的抗菌效果，老鸛草乙醇提取物對糞鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及鮑曼不動桿菌有高敏抑制活性（抑菌圈≥16 mm），其MIC值分別為1.0、1.0 、1.0 、2.0 mg·mL?1。對肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、多耐銅綠假單胞菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌有中敏抑制活性（抑菌圈直徑：11 ～15 mm），其MIC值分別為4.0 、4.0 、4.0 、4.0 、8.0 、4.0、4.0 mg·mL?1。對藤黃微球菌有微弱抑菌活性（抑菌圈≤10 mm），其MIC值為16.0 mg·mL?1（表4）。

表 3 老鸛草乙醇提取物各黃酮化合物含量表（means±SD，n=6）Table 3 Flavone contents in G. wilfordii ethanol-extract

表 4 老鸛草乙醇提取物的抗菌活性（means±SD，n=3）Table 4 Antibacterial activity of G. wilfordii ethanol-extract

3 討論與結(jié)論

細(xì)菌耐藥性問題的日益惡化和我國限抗和禁抗政策的落地，讓抗生素替代品的研究越發(fā)迫切[21]。Kim等[22]學(xué)者曾用239種中草藥乙醇提取物對7株多重耐藥金黃色葡萄球菌的廣譜抑菌活性進(jìn)行系統(tǒng)評價，發(fā)現(xiàn)了74種中草藥具有良好的抑菌活性，說明傳統(tǒng)中草藥來源的活性成分具有開發(fā)成為抗菌藥物替代物的良好潛力。

老鸛草乙醇提取物被發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性，對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用[23]，能抑制幽門結(jié)扎型胃潰瘍大鼠胃酸分泌、抑制胃蛋白酶活性[5,11]，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、停乳鏈球菌、雞沙門氏桿菌的抑菌效果良好[24]。老鸛草乙醇提取物的主要活性成分為鞣質(zhì)類、黃酮類、有機(jī)酸和揮發(fā)油類化合物[25,26]，程小偉等[27]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)老鸛草乙醇提取物中的山柰酚、沒食子酸衍生物和黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌活性。 楊秀芳等從老鸛草屬植物中共分離、鑒定了約39個鞣質(zhì)類化合物、35個黃酮類化合、8個有機(jī)酸類化合物[28]。研究表明老鸛草中鞣質(zhì)具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降糖保肝等作用[29]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)恩施地區(qū)老鸛草乙醇提取物具有優(yōu)良抗菌活性和廣譜性，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌及鮑曼不動桿菌有高敏抑制活性，對肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、多耐銅綠假單胞菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌有中敏抑制活性。本研究首次鑒定了恩施地區(qū)老鸛草乙醇提取物的揮發(fā)成分主要為脂肪烴（5.72%）、脂肪酸（17.09%）、生物堿（1.15%）。首次測定了恩施地區(qū)老鸛草乙醇提取物中的3個黃酮類化合物的含量：花旗松素（3.72 mg·g?1）、楊 梅 苷（2.56 mg·g?1）、槲 皮 素-3-O-β-D-葡萄糖（5.56 mg·g?1）。

恩施地區(qū)老鸛草乙醇提取物具有優(yōu)良抗菌活性和廣譜性，為開發(fā)新型植物來源的抗生素提供了重要參考。但是老鸛草乙醇提取物中發(fā)揮抑菌功能的活性成分和抑菌機(jī)制，還有待進(jìn)一步分析研究。