陳小明，曾少敏，黃新忠

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所／福建省落葉果樹工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】避雨栽培是目前常用的一種梨樹種植方式，具有減少花期雨季落花、提高坐果率、縮短果實成熟時間、提高果實品質(zhì)和減少病蟲害等優(yōu)勢[1?3]，而避雨栽培改變果園微域環(huán)境，特別是土壤環(huán)境，因而研究其對根際土壤細菌群落的影響，對完善避雨栽培下土壤管理措施具有重要意義。【前人研究進展】近些年來隨著梨樹種植的增加，梨樹病蟲害和惡劣的自然環(huán)境對梨品質(zhì)和產(chǎn)量的相關(guān)報道越來越多[4?6]。為減少病蟲害以及自然災(zāi)害對梨品質(zhì)和產(chǎn)量的影響，避雨栽培模式在梨樹種植的應(yīng)用越來越多。避雨栽培下梨銹病和梨黑斑病的發(fā)病指數(shù)要明顯小于露天栽培[7]，且改善梨的外觀，果實可溶性固形物和可溶性總糖含量都分別提高，可滴定酸含量和果實硬度都顯著下降[8]。避雨栽培對梨品質(zhì)和產(chǎn)量的研究相對較多，但避雨處理對梨樹土壤的影響等研究相對較少，陳小明等[9]研究發(fā)現(xiàn)避雨栽培會減小梨樹根際土壤酶活性。植物根際有一個復(fù)雜的微生物群落，它直接影響著植物的生長、健康和發(fā)育，根際微生物的群落結(jié)構(gòu)受植物根際分泌物和土壤環(huán)境的影響[10?11]?！颈狙芯壳腥朦c】避雨措施會影響梨樹的生長，這勢必會改變梨樹的根際土壤環(huán)境，但對于避雨栽培下梨樹根際土壤微生物的影響還未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以同一梨園中避雨栽培和露地栽培的梨樹為研究對象，測定梨果實品質(zhì)、土壤理化性質(zhì)和土壤微生物多樣性，比較不同模式下梨樹根際土壤根際微生物的變化與果實品質(zhì)和土壤化學(xué)性質(zhì)變化的相關(guān)性。為制定不同栽培模式下定向調(diào)控土壤微環(huán)境、提高水果品質(zhì)和保護土壤環(huán)境等措施提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗地點

試驗果園為福建省建寧縣溪口鎮(zhèn)枧頭村67 hm2（約40 000棵）30年生翠冠梨山地果園（東經(jīng)116°48′34″，北緯26°50′38″），其中11.3 hm2（約6 800棵）從2013年開始采用蓋棚避雨栽培（TYGH），其余為無蓋棚露地栽培（TY）。

1.2 梨果實品質(zhì)分析

2018年7月14日進行梨的果實取樣，取樣方法為，按照5點取樣法，在避雨栽培區(qū)和露地栽培區(qū)各隨機選取5棵梨樹。在每棵梨樹的上層和下層的不同方位按東、西、南、北4個方位上，代表性的采4個果實，每棵樹共采8個果實，每個處理共采40個。樣品放入冰盒保存，當天帶回實驗室進行果實品質(zhì)分析。

將帶回實驗室的果實，每個處理隨機選擇10個果，去皮后取中部果肉切碎混勻，重復(fù)4次。果實品質(zhì)分析的測定參照中華人民共和國食品安全國家標準測試。測試方法如下：蔗糖含量測定采用《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》（GB/T 5009.8—2016）[12]，還原糖含量測定采用《食品中還原糖的測定》（GB/T 5009.7—2016）[13]，抗壞血酸含量測定采用《食品中抗壞血酸的測定》（GB/T 5009.86—2016）[14]，總酸含量測定采用《食品中總酸的測定》（GBT12456—2008）[15]。

1.3 土壤取樣

隨機選取避雨栽培的5株健壯梨樹，同時在露地栽培區(qū)也隨機選取5株健壯梨樹，在距離樹干1 m處，用鐵鏟挖10～20 cm深達梨樹根，將樹根取出，將根表面土壤刷下，然后把所有根系上刷下來的土壤剔除樹根，充分混勻，每棵取500 g左右，共計2 500 g。帶回實驗室保存于冰箱（?4 ℃）備用。

1.4 土壤化學(xué)測定

土壤樣本取部分進行自然風(fēng)干，碾碎，過2 mm篩，按四分法取樣，參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》方法[16]，測定土壤的pH值和全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效磷、速效鉀以及有機質(zhì)含量和含水量，所有指標測定均重復(fù)3次。具體如下：

1.4.1 土壤全氮和速效氮測定 速效氮含量包括測定的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的總和，銨態(tài)氮含量采用奈氏試劑法進行測定；硝態(tài)氮含量采用紫外分光光度法進行測定。全氮測定時先采用重鉻酸鉀硫酸消解法進行消解，再采用凱氏定氮法進行測定。

1.4.2 土壤全磷、全鉀、速效磷和速效鉀測定 用NaHCO3浸提土壤樣品后采用鉬銻抗比色法進行速效磷含量測定。利用NH4OAc浸提土壤，然后采用火焰光度法進行速效鉀含量測定。全磷和全鉀測定時先采用H2SO4-HClO4法進行消煮分解，再采用測定速效磷和速效鉀的方法進行測定。

1.4.3 土壤有機質(zhì)、pH和含水量測定 采用重鉻酸鉀-硫酸亞鐵滴定法進行土壤有機質(zhì)含量測定。

pH值測定簡述為：取10 g土于250 mL燒杯中，加入25 mL無二氧化碳水，充分攪拌后平衡30 min。取上層清水，將校正好的pH計電極放入測定pH。

含水量測定簡述為：先稱取鋁盒重量a，記錄后加入新鮮土壤，記錄鋁盒和土壤的總重量m，放入烘箱100 ℃，24 h，后取出放在干燥器中冷卻，稱量鋁盒和土壤的總重量b。土壤含水率=[（b?a）/（m?a）]×100%。

1.5 土壤DNA提取和測序

土壤總DNA的提取采用MoBio PowerSoil DNA isolation kit（Carlsbad, CA, USA）。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和分光光度法對提取到的DNA樣品進行質(zhì)量檢測。將檢測合格的樣品于?20 ℃保存?zhèn)溆?。采?38F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對細菌16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)進行擴增[17]。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括12.5 μL 2× Taq PCR MasterMix，3 μL BSA（2 ng·μL-1）， 2 Primer（5 μM）， 2 μL模板DNA，和5.5 μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[18]。每個樣品重復(fù)3次，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN, Germany）凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；利用RT-PCR進行定量，PCR產(chǎn)物送北京奧維森基因公司進行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

通過Illumina MiSeq平臺進行Paired-end測序，下機數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除打分低（≤20），堿基模糊，引物錯配或測序長度小于150 bp的序列[19,20]。根據(jù)barcodes規(guī)類各處理組序列信息聚類為用于物種分類的OUT（Operational Taxonomic Units），OTU相似性設(shè)置為97%（Edgar，2013）[21]。對比silva數(shù)據(jù)庫，得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息[22]。再利用Mothur軟件（version 1.31.2）進行α多樣分析（包括Shannon和Chao1等2個指數(shù)）[23]?；赪eighted Unifrace距離，使用R（v3.1.1）軟件包的pheatmap進行聚類分析[24]。經(jīng)過UniFrac算法利用系統(tǒng)進化的信息來比較樣品間物種群落差異，并進行Beta多樣性（Beta diversity）分析[25]。利用LEfSe分析進行不同處理根際細菌在豐度上有顯著差異的細菌[26]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用DPS軟件分析數(shù)據(jù)，采用LSD法（最小顯著差法）進行顯著性差異分析，IBM SPSS Statistics 19.0進行數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析，Umetrics SIMCA 13.0軟件進行數(shù)據(jù)的主成分分析，并采用OriginLab OriginPro 2018進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨樹果實品質(zhì)分析

梨果實品質(zhì)測定結(jié)果表明，梨樹避雨處理的果實蔗糖、還原糖含量要顯著高于露地處理的，分別提高1.83倍和1.08倍，同時維生素C和總酸含量要顯著低于露地處理的，分別減少了1.23倍和1.20倍（表1）。避雨處理果實的糖酸比要比露地處理的高19.45?？梢姳苡晏幚碛欣谔岣吖麑嵦呛亢徒档退岷?，提高果實的糖酸比，從而有可能改善風(fēng)味品質(zhì)。

表 1 不同栽培模式下梨果實品質(zhì)Table 1 The pear fruit qualities under different cultivation modes

2.2 梨園土壤化學(xué)性質(zhì)

土壤化學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果表明，在避雨處理的土壤速效磷、速效鉀、有機質(zhì)含量和含水量都要顯著低于露地處理，全鉀、速效氮含量和pH值都與露地處理沒有顯著差異，全氮含量顯著高于露地處理（表2）?？梢娐兜靥幚砝谕寥浪傩Я?、鉀含量、有機質(zhì)和含水量的提高，可能對果實的產(chǎn)量有重要作用。

表 2 不同栽培模式下梨樹根際土壤化學(xué)性質(zhì)Table 2 Chemical properties of soils from different treatment plots

2.3 梨園土壤微生物測序分析

2.3.1 微生物序列分析 對梨樹根際土壤微生物測序結(jié)果表明，避雨處理的RT（Raw_tags）數(shù)量和CT（Clean_tags）要顯著低于露地處理，但最終的OUT數(shù)目要顯著高于露地處理（表3）。說明避雨處理的梨樹根際土壤微生物數(shù)量更多。

表 3 梨樹根際土壤微生物序列拼接結(jié)果和OUT數(shù)目統(tǒng)計Table 3 Sequence alignment and OUT number statistics of pear rhizosphere soil microorganism

圖 1 不同栽培模式下梨樹根際土壤細菌群落的門級（A）和屬級（B）分類組成Fig. 1 Taxonomic composition of bacterial communities in the rhizosphere soil of pear trees at the phylum level and genus level under different cultivation modes

2.3.2 梨園土壤微生物α多樣性和豐富度 避雨處理的梨樹根際土壤在門水平的細菌群落主要以變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和放線菌門（Actinobacteria）為主（圖1-A）；在屬水平的細菌群落主要以不可培養(yǎng)細菌（uncultured bacterium）、不可培養(yǎng)的森林土壤細菌（uncultured forest soil bacterium）和不可培養(yǎng)的變形菌（uncultured proteobacterium）為主（圖1-B）。避雨處理的梨樹根際土壤細菌群落的平均Shannon指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)）和Chao1都要大于露地處理的，避雨處理顯著提高土壤細菌的多樣性（P＜0.05）?？梢?，避雨處理可以提高梨樹根際土壤細菌群落的豐富度和多樣性（圖2）。

圖 2 不同栽培模式下梨樹根際土壤細菌群落的α多樣性（香農(nóng)指數(shù)A）和豐富度（B）Fig. 2 The alpha diversity（Shannon index, A）and abundance（Chao1, B）of rhizosphere soil bacteria of pear trees under different cultivation modes.

2.3.3 梨園土壤微生物β多樣性 PCA分析結(jié)果表明，主成分1可以很好地區(qū)分避雨處理和露地處理的梨樹根際土壤細菌群落，主成分1解釋變量方差的74.31%（圖3）。

圖 3 不同栽培模式下梨樹根際土壤細菌群落主成分分析Fig. 3 rincipal component analysis of bacterial community in pear rhizosphere soil under different cultivation patterns

2.3.4 梨園土壤微生物分類構(gòu)成 從圖4可以看出，避雨處理會使梨根際微生物產(chǎn)生差異。避雨處理的梨樹根際微生物Gemmatimonadales、Chloroflexi、Nitrosomonadales、Thermoleophilia、Sphingomonadaceae、Streptomyces、Candidatus Koribacter、Hyphomicrobiaceae、Micrococcales、Micromonosporales、Acidimicrobiales、Corynebacterium、Anaerolinea的數(shù)量要顯著大于露地處理。露地處理梨樹根際微生物Solibacterales、Actinospicaceae、Corynebacteriaceae、Acidothemceae、Frankiales、 Chitinophagaceae、 Sphingobacteriales、Thermogemmatisporales、Roseiarcaceae、Acetobacteraceae、Rhodospirillales、Alcaligenaceae、Burkholderiaceae、Polyangiaceae、 Myxococcales、 Deltaproteobacteria、Xanthomonadaceae的數(shù)量要顯著大于避雨處理。

2.4 相關(guān)性分析

梨樹不同管理處理的根際土壤微生物在屬水平與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性結(jié)果表明（圖5-A），主成分1解釋了變量方差的87.41%，主成分2解釋了變量方差的10.26%，梨樹根際屬水平微生物差異相關(guān)系數(shù)絕對值最高的是土壤速效鉀含量。與露地處理根際屬水平微生物差異相關(guān)系數(shù)最高的是土壤速效鉀含量，而避雨處理梨樹根際屬水平微生物差異相關(guān)系數(shù)絕對值最高的則是土壤總氮含量。說明避雨處理對微生物屬水平影響最大的是土壤氮素水平。果實的蔗糖含量與避雨處理梨樹根際屬水平微生物差異相關(guān)系數(shù)最高，果實的總酸含量與露地處理梨樹根際屬水平微生物差異相關(guān)系數(shù)最高（圖5-B）。說明避雨處理可能通過影響土壤微生物來影響果實品質(zhì)。

3 討論

避雨設(shè)施栽培的應(yīng)用是減少作物病蟲害、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的一個重要措施[3,27?29]。本研究發(fā)現(xiàn)山地避雨處理會提高梨的甜度，同時減少梨的總酸含量，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[3,8,30?32]；陳小明等[9]對田地避雨栽培研究表明，田地避雨栽培并沒有提高梨果實總的含糖量，但酸性物質(zhì)含量有所增加，這與本研究結(jié)果不同，可能是由于田地與山地立地條件不同，土壤水肥養(yǎng)分積累及消耗能力不同。相對于田地，由于山地早晚溫差大，紫外線強，梨樹生長過程中應(yīng)激響應(yīng)大，梨樹吸收礦質(zhì)營養(yǎng)元素的效率更低，導(dǎo)致果實的酸度大。同時，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，避雨處理土壤微生物屬水平上的變化趨勢與梨的蔗糖含量和還原糖含量相關(guān)性最大，通過定向調(diào)控土壤微生物種群的變化，提高梨的品質(zhì)。

李艷麗等[33]利用土壤覆蓋管理方式研究不同土壤管理方式差異對梨園土壤微生物的影響，發(fā)現(xiàn)蓋膜處理使土壤中的速效養(yǎng)分減少，而本研究中避雨栽培降低了土壤中速效磷、速效鉀、有機質(zhì)含量和含水率，兩者研究結(jié)果一致。這可能是由于避雨處理梨樹生長的要比露地處理的好，需要的土壤速效營養(yǎng)物質(zhì)更多，最終導(dǎo)致果實品質(zhì)更好。梨樹生長需要土壤提供有效的養(yǎng)分和水分，在同等情況下，避雨處理防止了雨水進入土壤，減少了土壤含水率，就可能減少了土壤中可溶性養(yǎng)分的溶解與釋放。本研究中相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)避雨處理土壤梨根際微生物的變化和土壤總氮、速效氮和pH顯著正相關(guān)，而氮素是植物生長主要的營養(yǎng)元素。因此，可以通過調(diào)控梨園的氮素水平來調(diào)控土壤根際微生物。植物可以改變根際土壤微生物，根際土壤微生物也可以顯著影響植物的生長、發(fā)育和對土源性病原體的抗性[34]。本研究發(fā)現(xiàn)避雨處理可以增加梨樹根際土壤微生物的α多樣性和豐富度，而微生物多樣性和豐富度的增加可以提高根際微生態(tài)的穩(wěn)定性和抗性。相關(guān)研究表明利用蓋膜方式管理梨園可以增加梨樹土壤微生物數(shù)量[33,35]，這與本研究結(jié)果一致。雖然，避雨處理雖然降低了土壤中K、P等有效養(yǎng)分和水分含量，但植物生長得更好，分泌更多的根系分泌物可以為根際微生物提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，這可能是導(dǎo)致避雨處理梨樹根際土壤微生物的多樣性和豐富度要高于露地處理的原因。

圖 5 不同栽培模式下梨樹根際土壤細菌群落的屬級分類下與土壤理化性質(zhì)（A）和梨品質(zhì)（B）的相關(guān)性分析Fig. 5 Correlation analysis between bacterial communities in the rhizosphere soil of pear trees at the genus level and the soil physio-chemical indexes（A）and fruit qualities under different cultivation modes

4 結(jié)論

生產(chǎn)實踐結(jié)果證明避雨栽培對于梨的產(chǎn)量和品質(zhì)都有提高作用。本研究表明，在山地種植的梨樹，避雨栽培可以提高增加土壤微生物多樣性和豐富度，增強梨樹根際微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，增加梨樹的抗逆性，從而提升梨樹果實的品質(zhì)。但是長期的蓋棚對于土壤物質(zhì)循環(huán)不利，不利于維持作物的長期生長需求。由于梨樹避雨栽培更有利于植株生長，根系分泌物也較多的，這導(dǎo)致了土壤微生物數(shù)量和多樣性有所增加，但是避雨處理不利于整個土壤物質(zhì)循環(huán)，需要適度的補充肥料和水分。田間實際生產(chǎn)過程中應(yīng)考慮長期的避雨處理帶來的負面影響，通過適當?shù)穆兜爻ㄩ_時間可以改善土壤物質(zhì)循環(huán)，有利于梨園生產(chǎn)的可持續(xù)和穩(wěn)定性。