趙艷艷 張麗華 張麗媛

摘?要?蛋白質(zhì)磷酸化是最常見(jiàn)、最重要的翻譯后修飾之一， 在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。但是， 磷酸化蛋白/肽具有低豐度和負(fù)電荷的特點(diǎn)， 在生物質(zhì)譜常規(guī)的正離子模式下， 易受到高豐度非磷酸化蛋白/肽的信號(hào)抑制， 難以直接對(duì)其進(jìn)行直接分析。因此， 有必要在質(zhì)譜分析前對(duì)生物樣品中的磷酸化蛋白/肽進(jìn)行選擇性富集。本研究基于三磷酸腺苷（ATP）配基， 制備了新型鋯離子固定化親和磁納米粒子（Zr4+-ATP-MNP）。掃描電鏡和元素分析的表征結(jié)果表明， Zr4+-ATP-MNP制備成功。采用所制備的Zr4+-ATP-MNP材料對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集， 以磷酸化蛋白β-酪蛋白（β-casein）的酶解液為選擇性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綐悠罚?采用質(zhì)譜法可鑒定出9條磷酸化肽; 以β-casein和非磷酸化蛋白牛血清白蛋白（BSA）酶解液（1∶100， n/n）混合物為干擾實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綐悠罚?采用質(zhì)譜可鑒定出5條磷酸化肽。富集后， 磷酸化肽的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度顯著提高， 可有效去除非磷酸化肽。Zr4+-ATP-MNP在牛奶酶解產(chǎn)物中的應(yīng)用進(jìn)一步表明， 其對(duì)復(fù)雜生物樣品中的單磷酸化肽和多磷酸化肽具有廣譜性的捕獲潛力。

關(guān)鍵詞?固定化親和; 磷酸化肽; 富集; 磁性

1?引 言

蛋白質(zhì)的磷酸化是一種普遍存在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期和激酶調(diào)控等重要生命活動(dòng)中起關(guān)鍵作用[1，2]?；谫|(zhì)譜的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為生物學(xué)研究提供了極佳的分析平臺(tái)[3]。然而，磷酸化蛋白的低豐度、動(dòng)態(tài)可逆、難以離子化等特點(diǎn)，使得難以對(duì)其直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。因此，發(fā)展可應(yīng)用于質(zhì)譜前生物樣品預(yù)處理的高選擇性富集材料，并將其應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究，具有重要意義。

金屬離子固定化親和色譜（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）是一種應(yīng)用廣泛的磷酸化肽選擇性富集技術(shù)[4～8]，主要利用固定后的金屬離子與磷酸化肽的磷酸根之間的螯合作用，實(shí)現(xiàn)材料對(duì)磷酸化肽的選擇性捕獲。常用的金屬離子有Fe3+ [9～12]、Ga3+ [7，13～15]和Ti4+ [8，16]等，常用于固定化金屬離子的基團(tuán)有亞氨基二乙酸（IDA）[9，17]和次氨基三乙酸（NTA）[8，10，12]等。為了提高富集選擇性，Zou和Zhang的研究組等發(fā)展了以磷酸根為配基的多種功能IMAC新材料[4，18～20]。最近，本研究組發(fā)展了以三磷酸腺苷（ATP）為配基的新型IMAC材料[15，16]。ATP含有3個(gè)磷酸根基團(tuán)，可同時(shí)提供多個(gè)金屬離子螯合位點(diǎn)，以其為螯合基團(tuán)的IMAC 材料可與金屬離子形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀化合物，為磷酸化肽提供高活性的富集位點(diǎn)。此外，ATP結(jié)構(gòu)中含有親水性基團(tuán)，如戊糖（核糖）和嘌呤堿（腺嘌呤），可顯著提高材料的親水性，降低對(duì)非磷酸肽的非特異性吸附，提高材料的磷酸化肽富集選擇性。前期研究結(jié)果表明，以ATP為配基固載單一種類金屬離子所制備的材料，難以實(shí)現(xiàn)單磷酸化肽和多磷酸化肽的同時(shí)高選擇性富集，如固載Ga3+后的Ga3+-ATP-MNP偏向于富集多磷酸化肽[15]，而固載Ti4+后的Ti4+-ATP-MNP更偏向于富集單磷酸化肽[16]。因此，有必要發(fā)展一種可同時(shí)富集單磷酸化肽和多磷酸化肽的富集方法。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究以磁性納米粒子為基質(zhì)，以ATP為功能化試劑，通過(guò)固定化Zr4+，制備了對(duì)單磷酸化肽和多磷酸化肽具有廣譜性富集效果的新型鋯離子固定化親和磁納米粒子（Zr4+-ATP-MNP）。此納米粒子對(duì)磷酸化肽的富集選擇性好，在牛奶酶解產(chǎn)物中的應(yīng)用表明，其具有捕獲復(fù)雜生物樣品中磷酸化肽的應(yīng)用潛力。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

JSM-6360 LV型掃描電鏡（JEOL， 日本Tokyo公司）;Ultraflex III MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker 公司）。三磷酸腺苷二鈉（ATP-Na2，純度≥99.9%，美國(guó)AMRESO公司）;氯氧化鋯（ZrOCl2，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）;β-酪蛋白質(zhì)（β-Casein）、牛胰蛋白質(zhì)酶（Trypsin）、牛血清蛋白質(zhì)（BSA）、尿素、2，5-二羥基苯甲酸（DHB）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、戊二醛（50%，w/w）、甲酸（FA）、三氟乙酸（TFA）、ZrO2 顆粒（5 μm）均購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司;乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）;其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）純化的超純水。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?Zr4+-ATP-MNP的制備?在前期研究工作[15，16]基礎(chǔ)上，制備了Zr4+-ATP-MNP。 以FeCl3·6H2O（1 g）、1，6-己二胺（3.6 g）與無(wú)水乙酸鈉（4 g）為原料、50 mL 乙二醇為溶劑，利用水熱合成法，在反應(yīng)釜中于200℃反應(yīng)6 h，得磁性納米顆?；|(zhì)。將磁性納米顆粒分別經(jīng)乙醇與水超聲清洗3次， 稱取100 mg，加入5 mL 戊二醛溶液（20% （w/w）， 100 mmol/L 檸檬酸緩沖液，pH 5.0），室溫下活化2 h。用檸檬酸緩沖液（100 mmol/L， pH 5.0），清洗5次，去除未反應(yīng)的戊二醛。加入3 mL ATP 溶液（0.2 g/mL， 100 mmol/L 檸檬酸緩沖液，pH 5.0），室溫下反應(yīng)2 h，使磁球納米粒子表面ATP 功能化。用檸檬酸緩沖液（100 mmol/L， pH 5.0）清洗5次，去除未反應(yīng)的ATP。最后加入10 mL ZrOCl2溶液（100 mmol/L， 0.1% （V/V） FA），固載Zr4+ 2 h，所得磁性納米粒子用0.1% （V/V） FA 清洗5次后，于0.1% （V/V） FA 中保存，備用。

2.2.2?樣品處理?將1.0 mg β-casein溶于1 mL NH4HCO3（50 mmol/L， pH 8.0）中，以1∶50（w/w）的酶-蛋白比例加入Trypsin，37℃酶解12 h。將1.0 mg BSA 溶于100 μL 含8 mol/L 尿素的50 mmol/L NH4HCO3中，56℃變性10 min，加入20 μL 100 mmol/L DTT， 56℃反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后，加入20 μL 200 mmol/L IAA，在暗處反應(yīng)30 min，用50 mmol/L NH4HCO3稀釋至1 mL后，以1：50（w/w）的酶-蛋白比例加入Trypsin， 37℃酶解12 h。脫脂牛奶經(jīng)Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，酶解流程同BSA。酶解產(chǎn)物經(jīng)甲酸中止反應(yīng)，于

80℃保存。

2.2.3?Zr4+-ATP-MNP應(yīng)用于磷酸化肽的捕獲?Zr4+-ATP-MNP的上樣、淋洗及洗脫條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[15，16]。即取5 μL Zr4+-ATP-MNP （10 μg/μL）與10 μL樣品溶液，在上樣溶液（50% ACN/5% TFA）中振蕩孵育30 min 后，分別用200 μL淋洗緩沖溶液1（50% ACN/5% TFA/200 mmol/L NaCl）、淋洗緩沖溶液2（80% ACN/5% TFA）和淋洗緩沖溶液3（30% ACN/0.1% TFA）順序淋洗，去除非磷酸化肽，最后加入50 μL NH4OH（15%，w/w）進(jìn)行洗脫，洗脫液凍干后，加入2 μL 的基質(zhì)溶液（25 mg/mL DHB，50% ACN/1% H3PO4）重溶后，進(jìn)行MALDI-TOF MS 分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?Zr4+-ATP-MNP材料表征

利用掃描電鏡對(duì)制備的Zr4+-ATP-MNP進(jìn)行了表征。由圖1A可見(jiàn)，制備的Zr4+-ATP-MNP形貌均一，為直徑150 nm左右的球形粒子。由元素分析結(jié)果（圖1B）可知，Zr4+-ATP-MNP主要含Zr、Fe、O等元素，進(jìn)一步證明Zr4+-ATP-MNP制備成功。

3.2?Zr4+-ATP-MNP對(duì)磷酸化肽的富集選擇性考察

以β-casein（純度90%，混有部分α-casein）為樣品，考察了Zr4+-ATP-MNP對(duì)磷酸化肽的選擇性，結(jié)果如圖2所示。由圖2A可見(jiàn)，不經(jīng)富集直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，僅檢出3條代表性磷酸化肽（m/z 2061、2555和3122），且信號(hào)幾乎被其它高豐度非磷酸化肽掩蓋。經(jīng)Zr4+-ATP-MNP富集后，上述3條磷酸化肽的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度顯著提高;此外，還檢測(cè)到1條源于β-casein（m/z 2431）和5條源于α-casein（m/z 1466、1660、1927、1951和2083）的磷酸化肽（圖2B）。商品化ZrO2顆粒僅可富集到6條磷酸化肽（圖2C）。以上結(jié)果表明，與商品化ZrO2顆粒的富集效果相比，Zr4+-ATP-MNP對(duì)低豐度磷酸化肽具有更強(qiáng)的親和作用力。此外，富集到的磷酸化肽中既含有單磷酸化肽（m/z 1461、1660、1951、2061、2083、2431和2555），又含有多磷酸化肽（m/z 1927和 3122）。以上結(jié)果表明，Zr4+-ATP-MNP對(duì)磷酸化程度不同的肽段具有廣譜性富集效果。本研究所檢測(cè)到的磷酸化肽氨基酸序列見(jiàn)表1。

以β-casein和 BSA 的混合物（1∶100， n/n）為干擾實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綐悠?，進(jìn)一步考察了Zr4+-ATP-MNP對(duì)復(fù)雜樣品中磷酸化肽的富集能力。由圖3A可見(jiàn)，未經(jīng)過(guò)富集直接檢測(cè)，僅能檢測(cè)到高豐度的非磷酸化肽，未檢測(cè)到磷酸化肽。但是，經(jīng)Zr4+-ATP-MNP富集后（圖3B），即使在高豐度的非磷酸化肽干擾下，源于β-casein的3條單磷酸化肽（m/z 2061、2431和2555）和源于α-casein的1條單磷酸化肽（m/z 2083）仍以高信噪比被檢出。此外，源于β-casein的1條多磷酸化肽（m/z 3122）還被高效鑒定。以上結(jié)果表明，即使在高豐度的非磷酸化肽干擾下， Zr4+-ATP-MNP對(duì)痕量的單磷酸化肽和多磷酸化肽均具有較好的捕獲能力。Zr4+-ATP-MNP中的抗干擾特性可歸結(jié)于ATP配基的親水性。ATP配基中含有親水性戊糖（核糖）和嘌呤堿（腺嘌呤），修飾ATP配基可顯著提高Zr4+固定化親和磁納米粒子材料的親水性，從而降低對(duì)非磷酸化肽的非特異性吸附。此外，ATP配基含有3個(gè)磷酸根基團(tuán)，可以同時(shí)提供多個(gè)Zr4+螯合位點(diǎn)，其與Zr4+形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀化合物，為磷酸化肽富集提供高活性的富集位點(diǎn)。

3.3?Zr4+-ATP-MNP用于牛奶蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的選擇性富集

進(jìn)一步以牛奶蛋白酶解產(chǎn)物為樣品，考察了Zr4+-ATP-MNP對(duì)實(shí)際生物樣品中磷酸化肽的富集能力。如圖4所示，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，由于非磷酸化肽的干擾和抑制效應(yīng)，磷酸化肽的信號(hào)較低，僅可檢測(cè)到2條磷酸化肽;經(jīng)Zr4+-ATP-MNP富集后，共檢測(cè)到11條磷酸化肽，磷酸化肽的鑒定數(shù)量和質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)均顯著提高。進(jìn)一步將此富集結(jié)果與前期發(fā)展的Ga3+-ATP-MNP[15]和 Ti4+-ATP-MNP[16]進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5所示。從富集后磷酸化肽質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的信噪對(duì)比結(jié)果可知，Zr4+-ATP-MNP對(duì)單磷酸化肽的富集能力與Ga3+-ATP-MNP和 Ti4+-ATP-MNP相當(dāng)（圖5A）;其對(duì)多磷酸化肽的富集能力強(qiáng)于Ti4+-ATP-MNP，與Ga3+-ATP-MNP相當(dāng)（圖5B）。并且，Zr4+-ATP-MNP對(duì)單磷酸化肽和多磷酸化肽的富集選擇性與Ti4+-ATP-MNP、Ga3+-ATP-MNP具有一定互補(bǔ)性。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，Zr4+-ATP-MNP對(duì)實(shí)際生物樣品中單磷酸化肽和多磷酸化肽具有廣譜性捕獲潛力。

1（College of Basic Medical Sciences， Dalian Medical University， Dalian 116044， China）

2（CAS Key Laboratory of Separation Sciences for Analytical Chemistry， Dalian Institute of Chemical Physics，

Chinese Academy of Sciences， Dalian 116023， China）

3（College of Pharmacy， Dalian Medical University， Dalian 116044， China）

Abstract?Protein phosphorylation is one of the most common and important post-translational modifications， which plays key regulatory roles in biological processes， such as cell signaling and apoptosis. However， due to the low abundance and negative charge of phosphorylated proteins， in the conventional positive ion mode of bio-mass spectrometry， phosphoproteins are susceptible to be suppressed by high-abundance non-phosphorylated proteins， making them difficult to be directly analyzed. Therefore， the enrichment of phosphorylated proteins/peptides prior to mass spectrometry is important in biological research. For the first time， in this study， a novel zirconium ion-immobilized affinity magnetic nanoparticle （Zr4+-ATP-MNP） was prepared using adenosine triphosphate （ATP） as the ligand. The ATP ligand in Zr4+-ATP-MNP contains three phosphate groups， which can simultaneously provide multiple zirconium ion chelating sites， thus form stable network compounds with zirconium ions and provide high activity towards phosphorylated peptide. In addition， the hydrophilic pentose （ribose） and purine （adenine） parts in the ATP structure can significantly increase the hydrophilicity of the material and reduce the non-specific adsorption from non-phosphorylated peptides. The results of scanning electron microscopy and elemental analysis indicated that Zr4+-ATP-MNP was successfully prepared. Using β-casein digest as the sample， 9 phosphopeptides were identified. From digest mixture of β-casein and BSA with molar ratio as low as 1∶100， five phosphopeptides were effectively identified with significantly improved signal and the non-phosphorylated peptides were effectively removed. The above results demonstrated the high specificity of Zr4+-ATP-MNP for both monophosphorylated peptides and multiphosphorylated peptides. The Zr4+-ATP-MNP was further applied to capture phosphopeptides in milk digest. All these results indicated the promising potential of Zr4+-ATP-MNP to capture mono-?and multi-phosphopeptides in complex biological samples.

Keywords?Immobilized affinity; Phosphopeptide; Enrichment ; Magnetic

（Received 18 November 2019; accepted 19 December 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21974017， 21505015）， the Project of CAS Key Laboratory of Separation Sciences for Analytical Chemistry， Dalian Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， the Program in Liaoning Province Education Department （No. LZ2019063）， the Natural Science Foundation of Liaoning Province， China （No. 20170540286）， and the Dalian High-level Talents Innovation Support Program （No. 20170540286）.