張剛　高曉慧　吳海兵　趙曉燕　顏敏超　李園　曾惠　郭曉珺

[摘要] 目的 研究地西他濱誘導(dǎo)人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 方法 常規(guī)體外培養(yǎng)人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞傳代24 h后加入不同濃度（0.5、1.0、5.0及10.0 μmol/L）地西他濱處理，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)地西他濱作用后人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株的凋亡率;應(yīng)用透射電鏡觀察人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)特征;實(shí)時(shí)熒光定量Real time-PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2在mRNA水平表達(dá)變化的情況。 結(jié)果 地西他濱可以抑制Jurkat細(xì)胞增殖，并且呈濃度和時(shí)間依賴性（P<0.05）。倒置顯微鏡觀察到地西他濱作用后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著改變;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明地西他濱能夠誘導(dǎo)人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞凋亡并且呈濃度依賴性（P<0.05）;透射電鏡觀察結(jié)果證明地西他濱可以誘導(dǎo)人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)凋亡性細(xì)胞死亡，5.0 μmol/L地西他濱作用Jurkat細(xì)胞72 h后出現(xiàn)大量凋亡小體。另外，Real time-PCR實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)地西他濱能夠上調(diào)促凋亡基因Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)。 結(jié)論 地西他濱能通過上調(diào)促凋亡基因Caspase-3的表達(dá)和下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 地西他濱;急性淋巴細(xì)胞白血病;Jurkat細(xì)胞;凋亡

[中圖分類號(hào)] R733.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）01-0026-05

Study on the mechanism of apoptosis induced by decitabine in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells

ZHANG Gang1? ?GAO Xiaohui2? ?WU Haibing1? ?ZHAO Xiaoyan1? ?YAN Minchao1? ?LI Yuan1? ?ZENG Hui1

GUO Xiaojun1

1.Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing? ?314000， China; 2.Department of Pediatrics， the First Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of apoptosis induced by decitabine in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells. Methods Human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cell line was routinely cultured in vitro. cells were harvested in logarithmic growth phase， and then treated with different concentrations （0.5， 1.0， 5.0 and 10.0 μmol/L） of decitabine after passage for 24 h. The cells were cultured continuously for 24， 48， and 72 hours respectively. The cell proliferation activity was measured by CCK-8 method. Cell morphology was observed under inverted microscope. Annexin V-FITC/PI staining flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cell line after decitabine treatment. The morphological characteristics of apoptosis in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells were observed by transmission electron microscopy. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of apoptosis-related genes Caspase-3 and Bcl-2. Results Decitabine inhibited Jurkat cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner （P<0.05）. Inverted microscopy showed significant changes in cell morphology after decitabine treatment. Flow cytometry detection of apoptosis showed that decitabine can induce apoptosis in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells in a concentration-dependent manner（P<0.05）. Transmission electron microscopy showed that decitabine can induce apoptotic cell death in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells， and a large number of apoptotic bodies appeared in Jurkat cells treated with 5.0μmol/L decitabine for 72 h. In addition， real time-PCR experimental results showed that decitabine can up-regulate the expression of the proapoptotic gene Caspase-3 and down-regulate the expression of the apoptosis-inhibiting gene Bcl-2. Conclusion Decitabine can induce apoptosis of cells by up-regulating the expression of apoptosis-promoting gene Caspase-3 and down-regulating the expression of apoptosis-inhibiting gene Bcl-2.

[Key words] Decitabine; Acute lymphoblastic leukemia; Jurkat cells; Apoptosis

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是由于原始淋巴細(xì)胞及幼稚淋巴細(xì)胞在造血組織異常增殖，并浸潤全身各組織臟器（尤其是肝、脾、淋巴結(jié)、腦脊液、睪丸、胸腺等組織臟器）的一種常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。在兒童與成人群體中均可發(fā)病，目前已經(jīng)成為兒童期最常見的惡性腫瘤[2]。而且ALL是全球范圍內(nèi)發(fā)病率高、致死率高的惡性腫瘤之一，僅僅在美國每年有大約27 000例被診斷為ALL，12 000例因ALL死亡[3]。隨著診斷技術(shù)水平的不斷提高及治療方案的不斷更新，特別是造血干細(xì)胞移植技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用，ALL患者的治愈率有了明顯提高[4]。盡管如此，仍有20%的患者將會(huì)面臨復(fù)發(fā)、死亡等風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，尋找一種更有效的抗ALL治療方法至關(guān)重要。

目前地西他濱（decitabine，DAC）在治療成人急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）等惡性疾病方面在臨床上已得到了廣泛的認(rèn)可及推廣[6-7]，但在臨床上尚未用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療。本研究中我們依據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，結(jié)合當(dāng)前抗急性淋巴細(xì)胞白血病研究的新熱點(diǎn)，探討了地西他濱是否具有誘導(dǎo)人ALL Jurkat細(xì)胞凋亡的作用及其可能的分子機(jī)制，為ALL的治療提供新靶點(diǎn)、新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

地西他濱（江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司）溶于生理鹽水，-20℃保存，使用時(shí)用生理鹽水稀釋至工作濃度;人ALL Jurkat細(xì)胞、青霉素、鏈霉素、70%乙醇、0.25% Tripsin-EDTA、PBS、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、50×TAE電泳緩沖液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）;Cell Counting Kit-8（日本 DOJINDO Laborataries）;RPMI-1640培養(yǎng)基（美國 GIBCO）;FBS（美國 ExCell Biology）;氯仿、異丙醇（中國 京化學(xué)試劑有限公司）、cDNA第一鏈合成試劑盒、Taq DNA Polymerase（美國 Thermo Fisher）、96 wellcell culture plate、6 wellcell culture plate、24 wellcell culture plate（美國 Corning Incorporated）;超凈工作臺(tái)（中國 蘇州凈化）;通風(fēng)櫥（中國 蘇州億達(dá)）;CO2培養(yǎng)箱（日本 SANYO）;2.5 μL、10 μL、200 μL、1000 μL移液器（德國 eppendorf）;生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）;振蕩器（中國 上海滬西分析儀器廠）;臺(tái)式低速離心機(jī)（中國 上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;立式壓力鍋（中國 上海博訊）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（中國 上海圣欣）;酶標(biāo)儀（美國 BioTek）;恒溫水浴箱（中國 常州國華電器有限公司）;高速冷凍離心機(jī)（德國 Sorvall）;多用脫色搖床（中國 江蘇金壇市正基儀器廠）;紫外光度儀（日本SHIMADZU）;普通梯度PCR儀（美國 ABI Veriti 96 well Thermal cycler）;熒光定量PCR循環(huán)儀（中國 中山達(dá)安）。

1.2 培養(yǎng)細(xì)胞

將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的ALL Jurkat細(xì)胞株懸液分裝入含有10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并將培養(yǎng)瓶放在37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換1次細(xì)胞培養(yǎng)基并傳代一次，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ALL Jurkat細(xì)胞株接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)調(diào)整為5×104個(gè)，每孔加入200 μL相應(yīng)的含有不同濃度地西他濱的培養(yǎng)基，使地西他濱終濃度分別為0.5、1.0、5.0及10.0 μmol/L，并設(shè)立未加藥的陰性對(duì)照組，每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3 h，搖床10 min輕輕混勻;λ=450 nm，酶標(biāo)儀讀出每孔的OD值，計(jì)算抑制率;IR（%）=[（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值]×100%，計(jì)算各組別抑制率及藥物IC50。

1.4 倒置顯微鏡觀察Jurkat細(xì)胞形態(tài)的變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ALL Jurkat細(xì)胞株接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)調(diào)整為5×104個(gè)，每孔加入200 μL相應(yīng)的含有不同濃度地西他濱的培養(yǎng)基，使地西他濱終濃度分別為0.5 μmol/L和5.0 μmol/L，并設(shè)立未加藥的陰性對(duì)照組，每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。

1.5 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按試劑盒說明書進(jìn)行操作，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ALL Jurkat細(xì)胞株接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)組別設(shè)置分別加入地西他濱終濃度分別為0.5 μmol/L和5.0 μmol/L的培養(yǎng)基，并設(shè)立未加藥的陰性對(duì)照組;藥物作用72 h后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞;用PBS洗滌細(xì)胞2次（離心2000 rpm，5 min）收集5×105細(xì)胞;加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI（Propidium Iodide），混勻;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，加入結(jié)合緩沖液后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的情況。

3 討論

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡過程相當(dāng)復(fù)雜，有多條信號(hào)通路及多基因參與，其中Bcl-2和Caspase系列基因被稱為是最經(jīng)典的細(xì)胞凋亡通路[8]。Bcl-2家族是一類在細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，Bcl-2是Bcl-2家族中最有代表性的凋亡抑制基因，在很多惡性腫瘤中大量表達(dá)（如胃癌、白血病等），且在腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[9]。因?yàn)榭沟蛲龅鞍譈cl-2與促凋亡蛋白Bax形成異源二聚體時(shí)具有抑制Bax蛋白活性的功能，所以當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)量也會(huì)增加，而當(dāng)同源二聚體Bax分開，其與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)，則能夠抑制細(xì)胞凋亡[10-11]。Czabotar PE等[12]研究結(jié)果顯示Bcl-2具有通過促進(jìn)細(xì)胞生存的途徑從而抑制細(xì)胞凋亡的作用，且過度表達(dá)將會(huì)使正常機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡，降低發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。Caspase-3是蛋白凋亡家族Caspase中的重要一員，其本質(zhì)是一種核酸內(nèi)切酶，具有執(zhí)行細(xì)胞凋亡的功能，當(dāng)Caspase-3蛋白酶活性被激活后，細(xì)胞就會(huì)發(fā)生不可逆的凋亡[13-14]。研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-3蛋白都會(huì)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[15-16]。相關(guān)研究結(jié)果顯示通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的方法治療白血病與應(yīng)用傳統(tǒng)抗腫瘤化療藥物相比具有毒副作用更小、療效更加顯著的優(yōu)勢(shì)[17]，所以積極探尋誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的新型藥物是目前治療白血病主要研究熱點(diǎn)、方向。

地西他濱（decitabine，DAC）是一種表觀遺傳學(xué)抑制劑，主要是通過磷酸化后直接摻入DNA，抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，引起DNA低甲基化從而恢復(fù)控制細(xì)胞分化增殖基因的正常功能來發(fā)揮抗腫瘤作用。目前地西他濱（decitabine，DAC）在治療成人急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）方面在臨床上已得到了廣泛的應(yīng)用，且已有研究報(bào)告顯示地西他濱對(duì)K562、MEL、S579等細(xì)胞株都具有抑制增殖、誘導(dǎo)其凋亡的作用[18]，但關(guān)于地西他濱對(duì)ALL Jurkat細(xì)胞株的作用研究很少，本研究結(jié)果表明，不同濃度的地西他濱對(duì)ALL Jurkat細(xì)胞株均具有不同程度的增殖抑制作用，且隨著地西他濱藥物濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)其抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)藥物濃度和作用時(shí)間依賴性。通過流式和透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明了地西他濱具有誘導(dǎo)ALL Jurkat細(xì)胞株凋亡的作用，這與王怡等[19]研究結(jié)果是相一致的。本研究還發(fā)現(xiàn)地西他濱可呈濃度依賴性下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)及上調(diào)促凋亡基因Caspase-3在mRNA水平的表達(dá)，這與劉進(jìn)等[20]實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是一致的。

綜上所述，地西他濱能夠顯著抑制ALL Jurkat細(xì)胞株的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，而下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)和上調(diào)促凋亡基因Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平可能是其分子機(jī)制，可為地西他濱應(yīng)用于ALL 的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-07-15）