彭曼曼，吳思凝，迪珂君，徐丹，張甫生

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)是一種天然高分子多糖，平均分子量約為1 000 kDa，易溶于水，可以吸收相當(dāng)于其自身80～100倍的水，通過氫鍵、偶極等作用力聚集形成巨型分子，具有優(yōu)良的親水性、凝膠性、成膜作用和增稠作用[1]。此外，KGM還具有多種生物學(xué)活性，如增強(qiáng)免疫力、抗肥胖、改善腸道微生物群、降血脂等[2-4]。大分子量雖然賦予了KGM優(yōu)良的黏結(jié)性，但也使得KGM流動性較差，不利于產(chǎn)品加工，使其在作為食品添加劑或功能性物質(zhì)應(yīng)用方面受到很大限制[5]。降解后KGM的黏度降低、流動性變佳，這不但能改善消費(fèi)者的口感體驗(yàn)、增加其在液體食品基質(zhì)中的應(yīng)用[6]，還符合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)要求，提高生產(chǎn)效率[7]。同時(shí)，黏度較低的KGM更有利于發(fā)揮其生物活性，如抗氧化活性[8]、益生菌活性[9]、提高機(jī)體免疫功能[10]、改善腸道環(huán)境[11]和維護(hù)皮膚健康[12]。因此，為了充分發(fā)掘和利用KGM在食品、醫(yī)藥及化工領(lǐng)域的潛力與價(jià)值，其黏度高、流動性差的問題亟待解決。

目前，降低KGM黏度的方法主要有酸法、堿法、酶法以及輻射處理，雖然這些方法均能改善KGM的流動性，但它們中有的會造成環(huán)境污染問題，有的則成本過高，不利于實(shí)際生產(chǎn)使用[13]。因此，還需要一種更加清潔、便利的技術(shù)來降低KGM黏度。近年來，超聲波因其具有頻率高、波長短、功率大、定向性好及便捷等特點(diǎn)，在食品加工領(lǐng)域日益展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢[14]。它不僅可提高提取、分離及加工反應(yīng)的效率[15]，還可以改善多糖大分子的黏度、流動性等流變特性，如超聲降解果膠[16]、黃原膠[17]、槐豆膠[18]等多糖大分子，其黏度與未處理組相比降低了60%～90%，且所得溶液穩(wěn)定性高。目前，有關(guān)超聲對KGM流變特性影響的研究，多集中在短時(shí)超聲處理降低KGM水溶液的黏度及部分結(jié)構(gòu)上[19-20]，鮮見關(guān)于探討超聲處理對KGM流變特性及微觀結(jié)構(gòu)等方面系統(tǒng)的研究。為此，本試驗(yàn)系統(tǒng)地研究了不同超聲處理時(shí)間、超聲處理功率對KGM溶膠的流變、分子間相互作用和微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期解決KGM黏度高、流動性差等突出問題，拓展KGM在飲料、酸奶、果凍等食品以及護(hù)發(fā)素、面霜等日用品中的應(yīng)用，為KGM加工應(yīng)用提供相關(guān)理論參考，也為其他大分子多糖的超聲改性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

KGM(食品級)，湖北七仙女生物有限公司；KBr(分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

SB-3200DTDN型超聲波機(jī)器，寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；FA2104型高精數(shù)顯電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Spectrum100紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；DHR-1型流變儀，美國TA儀器；S-3000N型掃描電鏡，HITACHI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 KGM溶膠制備及超聲處理

準(zhǔn)確稱取KGM 0.400 g，快速攪拌至完全溶解于50.0 mL純水后，置于40 ℃水浴鍋中溶脹1.5 h，取出，將其在設(shè)置特定參數(shù)的超聲波機(jī)器中進(jìn)行處理。超聲過程中在裝有樣品的燒杯外圍加入冰塊，維持其恒定溫度。然后把處理后的樣品置于常溫環(huán)境下待測。

按前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以加工效率及效果為依據(jù)，設(shè)定超聲處理參數(shù)：(1) 處理時(shí)間0、30、60、120、240 min，功率180 W；(2) 超聲波處理功率為0、72、108、144、180 W(超聲波機(jī)器總功率為180 W，有效功率范圍40%～99%)，處理時(shí)間240 min。

1.2.2 流變性質(zhì)的測定

取適量KGM溶膠于直徑為60 mm的平行板轉(zhuǎn)子上，設(shè)置測試間隙為1 000 μm，當(dāng)探頭到達(dá)設(shè)定位置后，小心擦去多余溶膠，并在周圍涂上硅油，防止在測試過程中水分揮發(fā)。加樣后，平衡時(shí)間1 min，然后在25 ℃下測定其流變學(xué)性質(zhì)[21]。(1)表觀黏度測定：剪切速率0.1～100 s-1，頻率1 Hz；(2)動態(tài)黏彈性測試：頻率掃描范圍為100～1 rad/s，應(yīng)變?yōu)?%。

1.2.3 傅里葉紅外光譜(FT-IR)

采用KBr壓片法，先將超聲處理后的樣品用冷凍干燥機(jī)處理48 h，然后取少量冷凍干燥后的樣品與KBr粉末按照1∶80的質(zhì)量比進(jìn)行研磨混合并壓片，以空氣作為參比并測試樣品，掃描范圍為4 000～400 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，連續(xù)掃描32次自動平均[22]。

1.2.4 掃描電子顯微鏡(SEM)

將超聲處理后的KGM溶膠倒入培養(yǎng)皿中預(yù)冷凍24 h，取出后進(jìn)行真空冷凍干燥處理48 h，然后取適量樣品固定于貼有導(dǎo)電膠的電鏡樣品銅臺上，噴金處理后送入樣品室進(jìn)行觀察，放大倍數(shù)分別為60倍和200倍，并選擇合適的區(qū)域拍照[23]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用OriginPro 8、SPSS 17.0進(jìn)行處理與分析，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，以Duncan(D)法(P<0.05)判定其顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對KGM溶膠表觀黏度的影響

2.1.1 處理時(shí)間對KGM溶膠表觀黏度的影響

超聲處理前后KGM的黏度均隨著剪切速率的增大而降低(如圖1)，屬于剪切變稀行為，表明KGM溶膠屬于非牛頓流體，具有假塑性。由圖1可知，超聲處理0～60 min的KGM溶膠表觀黏度下降幅度較小，從120 min起，表觀黏度下降幅度較明顯；在剪切速率為21.9 s-1時(shí)，處理30 min的KGM溶膠表觀黏度下降5.6%(P<0.05，下同)，處理60 min的KGM溶膠表觀黏度下降了12.0%，而處理120 min與240 min的KGM溶膠表觀黏度則分別下降了25.6%和 46.3%。這與10 g/L的KGM隨著超聲時(shí)間的增加，其黏度值降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[24]。短時(shí)超聲處理對KGM溶膠黏度的影響不大，而延長超聲時(shí)間能夠顯著降低KGM溶膠的黏度，處理時(shí)間越長黏度降低越多。這是由于短時(shí)超聲處理時(shí)，只有部分KGM分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，其整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)仍然存在，而隨著超聲處理時(shí)間的增加，KGM分子間作用力削弱，KGM溶膠網(wǎng)絡(luò)受到越來越嚴(yán)重的破壞，從而使KGM溶膠的表觀黏度降低[19, 25]。

圖1 超聲時(shí)間對KGM溶膠表觀黏度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time treatment on apparentviscosity of KGM sol

運(yùn)用冪定律τ=Kγn回歸擬合KGM剪切速率與剪切應(yīng)力數(shù)據(jù)，稠度系數(shù)K、流動指數(shù)n、相關(guān)系數(shù)r2等參數(shù)如表1所示。所有r2均在0.965～0.992范圍內(nèi)，表明預(yù)測方程均能恰當(dāng)擬合流變曲線。n在0.273～0.359范圍內(nèi)，均小于1，表明超聲處理前后KGM溶膠均為假塑性流體，超聲作用并不會改變KGM流體本質(zhì)[26]。K隨著超聲時(shí)間的增加而減小，超聲30、60、120、240 min后，K分別下降了18.4%、18.2%、37.2%和62.5%，這是超聲破壞作用延長造成的。KGM溶脹后，大分子通過纏結(jié)會形成巨型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，分子間作用力具有一定抵抗外力破壞的作用[27]，因此超聲30和60 min后KGM稠度系數(shù)K變化較小。隨著超聲時(shí)間的增加，KGM完整網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被逐步瓦解，因此超聲240 min后稠度系數(shù)K顯著減小[20]。

表1 不同超聲時(shí)間處理的KGM流變特性擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of rheological propertiesof KGM after different ultrasonic time treatment

注：同列不同字母表示各數(shù)據(jù)間具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.1.2 處理功率對KGM溶膠表觀黏度的影響

KGM的表觀黏度隨著超聲功率的增大而降低(如圖2)，在剪切速率為21.9 s-1時(shí)，與未經(jīng)超聲處理的KGM相比，72～144 W超聲處理后KGM溶膠的表觀黏度下降了24%～28%，180 W超聲處理后KGM溶膠的表觀黏度則下降了66.1%，下降幅度約為72～144 W處理的兩倍。不同功率超聲降解冬蟲夏草多糖有類似的結(jié)果，在51 W/cm2超聲處理的冬蟲夏草多糖黏度降幅為12 W/cm2的6倍[28]。隨著超聲功率的增大，溶膠所受的能量增加， “空化”作用加強(qiáng)，當(dāng)超過臨界值時(shí)，聲壓能量大于溶膠的內(nèi)聚力，溶膠結(jié)構(gòu)則被破壞[29]。這些空化泡破裂時(shí)會產(chǎn)生局部高壓和劇烈溫變，從而達(dá)到降低KGM分子量的效果，增強(qiáng)了KGM溶膠的流動性[30]。超聲波作為一種機(jī)械波通過空化作用[31]將KGM吸水溶脹完全之后形成的緊密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)撕裂，并降低KGM分子量，從而使得其黏度降低[32]。當(dāng)功率為180 W時(shí)，KGM網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)已被嚴(yán)重破壞，溶膠流動性相對較強(qiáng)，因而其表觀黏度有較大幅度的降低。

圖2 超聲功率對KGM溶膠表觀黏度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power treatment on theapparent viscosity of KGM sol

運(yùn)用冪定律τ=Kγn回歸擬合KGM剪切速率與剪切應(yīng)力數(shù)據(jù)，稠度系數(shù)K、流動指數(shù)n、相關(guān)系數(shù)r2等參數(shù)如表2所示。所有r2均在0.953～0.989范圍內(nèi)，表明預(yù)測方程較為準(zhǔn)確。n在0.267～0.334范圍內(nèi)變化，均小于1，表明不同超聲功率處理后的KGM溶膠也是假塑性流體，其流體本質(zhì)并未發(fā)生改變。K隨著超聲功率的增加而減小，72、108、144、180 W超聲后，K分別下降了12.5%、16.6%、32.6%和52.8%。當(dāng)超聲功率較低時(shí)，因超聲所形成的空化泡較小，隨著功率的增加，空化作用加強(qiáng)，破壞能力也變得更高[33]。因此，在相同作用時(shí)間內(nèi)，使用越高的超聲功率處理，KGM網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，宏觀性質(zhì)即表現(xiàn)為稠度系數(shù)K越小，這與前文黏度變化相一致。

表2 不同超聲功率處理的KGM流變特性擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of rheological properties ofKGM after different ultrasonic power treatment

2.2 超聲處理對KGM溶膠動態(tài)黏彈性的影響

2.2.1 處理時(shí)間對KGM溶膠動態(tài)黏彈性的影響

動態(tài)黏彈性是凝膠力學(xué)性能的重要評價(jià)指標(biāo)，它包括儲能模量(G′)和損耗模量(G″)，G′表示凝膠受力作用后變形程度，是衡量彈性的尺度，而G″則表示凝膠受力作用時(shí)阻礙物質(zhì)流動的性質(zhì)，是衡量黏性的尺度[34]。膜液加工的過程是一個(gè)動態(tài)變化的過程，動態(tài)黏彈性表示的是物質(zhì)在變形范圍內(nèi)的黏彈性質(zhì)及其變化規(guī)律，可為其產(chǎn)品配方、加工工藝以及設(shè)備選擇提供參考依據(jù)。

不同時(shí)間超聲處理樣品的G′、G″均隨著頻率的增加而升高(圖3)。KGM溶膠在此濃度下，G′總是高于G″，表現(xiàn)出彈性體性質(zhì)。隨著超聲處理時(shí)間延長，G′和G″都隨之降低；在角速度為75.0 rad/s時(shí)，與未經(jīng)超聲處理的KGM溶膠相比，超聲處理時(shí)間為30、60、120、240 min的KGM溶膠的G′分別下降了16.8%、27.4%、39.1%、44.3%，G″則分別下降了15.3%、29.4%、42.9%、55.1%。LIN等[35]使用超聲處理濃度為3%的KGM溶膠，超聲時(shí)間由8 min增加至15 min后，G′和G″也出現(xiàn)顯著下降，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。溶膠中的KGM大分子受氫鍵、范德華力的作用而相互交疊、纏結(jié)[36]，超聲作用初期，主要是KGM大分子長鏈解聚占主導(dǎo)地位，解聚使得分子鏈之間的覆蓋、交疊、纏結(jié)減少，隨著超聲處理時(shí)間的延長，超聲波引起的空化作用效果逐漸加強(qiáng)，長分子鏈斷裂，分子量降低，相對滑動變得容易，分子間的阻力也變小[37-38]，因而KGM溶膠的流動性也增強(qiáng)，表現(xiàn)為動態(tài)黏彈性的降低。這與靜態(tài)剪切中表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低是一致的。

a-儲能模量(G′)；b-損耗模量(G″)圖3 超聲時(shí)間對KGM溶膠動態(tài)黏彈性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time treatment on thedynamic viscoelasticity of KGM sol

2.2.2 處理功率對KGM溶膠動態(tài)黏彈性的影響

不同功率超聲處理對KGM的黏彈性具有顯著影響，呈現(xiàn)出超聲功率越大其黏彈性越低的趨勢(圖4)。隨著超聲處理功率的增加，G′和G″都隨之降低；在角速度為75.0 rad/s時(shí)，與未經(jīng)超聲處理的KGM溶膠相比，超聲功率為72、108、144、180 W的KGM溶膠的G′分別下降了20.0%、26.3%、35.2%、43.2%，G″則分別下降了21.6%、30.6%、27.1%、41.0%。超聲功率較小時(shí)，空化過程是穩(wěn)態(tài)空化，空化泡的振動幅度變化較小，隨著超聲功率的增大，空化泡的運(yùn)動加劇，振動幅度變大，此時(shí)，空化過程便會由穩(wěn)態(tài)空化轉(zhuǎn)變?yōu)樗矐B(tài)空化，加強(qiáng)空化效應(yīng)[39]。由G′與G″隨頻率變化的曲線可以看出，108 W與144 W對KGM溶膠的作用效果較為相似，這有可能就是正處于穩(wěn)態(tài)空化向瞬態(tài)空化轉(zhuǎn)變的過渡時(shí)期。隨著功率的增加，KGM溶脹形成的致密網(wǎng)格結(jié)構(gòu)在一定程度上被破壞，KGM大分子的纏結(jié)點(diǎn)發(fā)生解纏作用，當(dāng)外力作用時(shí)，分子鏈之間更容易發(fā)生相對滑動，即分子流動性增加[40]，故在動態(tài)黏彈性測試中表現(xiàn)為G′與G″降低。

a-儲能模量(G′)；b-損耗模量(G″)圖4 超聲功率對KGM溶膠動態(tài)黏彈性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power treatment on thedynamic viscoelasticity of KGM sol

2.3 不同超聲處理下KGM的FT-IR表征分析

由圖5可知，KGM的特征吸收峰沒有發(fā)生明顯位移或峰面積的改變，即超聲對KGM分子的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元及功能基團(tuán)并無影響。YAN等[42]在研究中也發(fā)現(xiàn)，超聲處理并不會改變海雀菌絲體多糖的一級結(jié)構(gòu)。TANG等[43]探索了超聲對青錢柳中多糖的影響，采用FT-IR檢測多糖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)超聲處理前后的結(jié)構(gòu)并無差異。由表3可以看出，超聲處理前后KGM的PK2、PK3、PK4、PK5峰值并未發(fā)生明顯變化，而主要的變化是發(fā)生在PK1上，超聲處理30、60、120、240 min后，PK1分別由3 424 cm-1變?yōu)? 407、3 408、3 401、3 392 cm-1，而超聲72、108、144和180 W處理后，PK1分別為3 409、3 402、3 399、3 392 cm-1。

圖5 不同超聲時(shí)間(a)、功率(b)處理后的KGM的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of KGM after different ultrasonictime(a) and power(b) treatment

表3 不同超聲處理后KGM紅外部分重要峰值數(shù)據(jù)Table 3 Some important peak data of KGM afterdifferent ultrasonic treatment

隨著超聲時(shí)間或超聲功率的增加，氫鍵特征峰出現(xiàn)在波數(shù)越小的位置，其中超聲240 min和180 W作用后變化最為顯著，下降比例均為0.93%。這與前文黏度和動態(tài)黏彈性在長時(shí)間、高功率超聲處理時(shí)的變化趨勢相似。KGM流變性質(zhì)的改變是由其分子間的氫鍵被超聲破壞，分子構(gòu)象發(fā)生改變， KGM分子流動性變強(qiáng)導(dǎo)致的[20, 44]。

2.4 超聲處理對KGM溶膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 處理時(shí)間對KGM溶膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

未經(jīng)超聲處理過的KGM溶膠(如圖6-a、f)的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出較完整的薄壁狀，且排列相對致密、有序、平整；超聲處理時(shí)間較短(30、60 min)的KGM的微觀結(jié)構(gòu)未有明顯變化，但邊緣開始卷曲，薄壁狀結(jié)構(gòu)也有所彎折(如圖6-b、g、c、h)；隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步延長，超聲120 min的KGM的薄壁狀結(jié)構(gòu)被破壞，卷曲、翻折加重，逐漸變成混亂無序的狀態(tài)(如圖6-d、i)；由圖6-e、j可以明顯看出，超聲240 min后，KGM溶膠原本較為完整的薄壁已經(jīng)被嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)較大直徑的孔洞，結(jié)構(gòu)變得稀疏、無序。這與前面流變性質(zhì)的改變是一致的，未經(jīng)超聲處理的KGM形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)較完整，大面積的連續(xù)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了相當(dāng)高的分子間內(nèi)摩擦力[45]，因而表觀黏度高，隨著處理時(shí)間延長，KGM分子鏈之間的氫鍵被破壞，分子鏈之間的纏結(jié)減少，從而表現(xiàn)出表觀黏度和動態(tài)黏彈性的減低。

a-0 min;b-30 min;c-60 min;d-120 min;e-240 min;f-0 min;g-30 min;h-60 min;i-120 min;j-240 mina、b、c、d、e放大倍數(shù)為×60；f、g、h、i、 j放大倍數(shù)為×200，下同圖6 不同超聲時(shí)間處理后KGM的SEM圖Fig.6 SEM of KGM after different ultrasonic time treatment

2.4.2 處理功率對KGM溶膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

超聲功率越大，空化作用越強(qiáng)，KGM分子鏈在水溶液中形成的氫鍵和范德華力受到的破壞越嚴(yán)重。圖7-a、f為未經(jīng)超聲處理的KGM溶膠，其微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出緊密連接且較完整的薄壁狀；圖7-b、g、c、h為相對較低的超聲功率(72、108 W)處理后的KGM溶膠，其微觀結(jié)構(gòu)沒有過于明顯的改變，但可以看出薄壁狀結(jié)構(gòu)已開始有部分折疊和卷曲；隨著超聲功率的增加，薄壁狀結(jié)構(gòu)邊緣卷曲加重，同一平面內(nèi)的連續(xù)結(jié)構(gòu)大面積斷裂，薄壁上開始出現(xiàn)更多的孔洞(如圖7-d、i)。180 W超聲處理后的KGM網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)已被完全破壞，由相對連續(xù)、平整變得斷裂、卷曲、松散(如圖7-e、j)。超聲功率越強(qiáng)，其卷曲、皺縮程度越高，這與前面流變性質(zhì)的改變是一致的，由于超聲波將KGM分子鏈間的氫鍵破壞，分子鏈的纏結(jié)減少，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得松散，從而表觀黏度和動態(tài)黏彈性隨之下降。

a-0 W;b-72 W;c-108 W;d-144 W;e-180 W;f-0 W;g-72 W;h-108 W;i-144 W;j-180 W圖7 不同超聲功率處理后KGM的SEM圖Fig.7 SEM of KGM after different ultrasonic power treatment

3 結(jié)論

KGM溶膠經(jīng)超聲處理后可使表觀黏度下降，且表觀黏度隨超聲時(shí)間和超聲功率的增加而降低；超聲時(shí)間越長、超聲功率越大，G′和G″越小。超聲能夠使KGM溶膠的連續(xù)結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊和卷曲，出現(xiàn)較大的孔洞，甚至變得稀疏且復(fù)雜無序。但由FT-IR結(jié)果可知，超聲對KGM分子的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元和功能基團(tuán)并不會造成影響，超聲主要是通過作用于KGM氫鍵部分來改變KGM的黏度及動態(tài)黏彈性。因此，超聲技術(shù)可作為一種改善KGM流動性的有效手段。超聲處理后KGM溶膠黏度較低，可應(yīng)用于護(hù)膚產(chǎn)品中，減少產(chǎn)品沉積、便于拿取、涂抹過程也更易勻開；添加于飲料或酸奶中，可提高產(chǎn)品穩(wěn)定性、改善產(chǎn)品口感、還能減少黏瓶現(xiàn)象。雖然超聲能夠提高KGM的流動性，使其更便于加工利用，但超聲對KGM生物活性和營養(yǎng)特性等方面的影響還有待進(jìn)一步研究。