劉麗萍,王力,詹曉北,朱莉,鄭志永,4*,高敏杰*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院)，江蘇 無錫，214122) 2(江蘇艾津農(nóng)化有限責(zé)任公司，江蘇 南京，211511) 3(無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125) 4(江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

高果糖漿作為一種新型的甜味劑，近年來得到廣泛應(yīng)用[1-2]。淀粉經(jīng)液化、糖化、異構(gòu)化等步驟得到果葡糖漿，果葡糖漿經(jīng)果葡分離后，果糖部分作為高果糖漿成品出售或再加工[3]，其余部分雜糖成分復(fù)雜，處理困難，增加了企業(yè)的負(fù)擔(dān)。

β-1,3-葡聚寡糖是一類重要的生理活性物質(zhì)[4-5]，具有抗菌抗腫瘤活性[6-9]。內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶能隨機(jī)斷開葡聚糖中的β-1,3-糖苷鍵，得到功能性寡糖(DP 2-10)[10]。因此，通過內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶降解β-1,3-葡聚糖是獲取β-1,3-葡聚寡糖的理想方法。

畢赤酵母是近年來極受青睞的一種外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[11]。其生長速度快，可達(dá)到高密度發(fā)酵，這讓碳源成為畢赤酵母發(fā)酵過程中消耗量最大的營養(yǎng)元素[12]。本研究室前期研究中分別利用PGAP和PAOX1兩種常規(guī)啟動子在畢赤酵母中分泌表達(dá)內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶，并驗(yàn)證其均能有效水解熱凝膠并獲得功能性β-1,3-葡聚寡糖[13]。PGAP型畢赤酵母多以葡萄糖為碳源，有數(shù)據(jù)顯示葡萄糖是PGAP型畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽-MP1102的最佳碳源[14]。PAOX1型畢赤酵母多以甘油為碳源，且其外源表達(dá)需要甲醇誘導(dǎo)[15]。葡萄糖和甘油市場價格都較昂貴，尋求一種廉價的替代性碳源可大幅度降低畢赤酵母發(fā)酵過程中的碳源費(fèi)用，具有非常大的商業(yè)價值。

本研究使用高果糖漿廢液雜糖(下文統(tǒng)稱為雜糖)作為碳源，使用2種不同啟動子(PAOX1、PGAP)調(diào)控的畢赤酵母外源表達(dá)β-1,3-葡聚糖酶。建立了1種雜糖廢液做碳源進(jìn)行發(fā)酵的資源利用的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株與試劑

內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶基因BGN13.1 (GenBank:X84085.1)來源于哈茨木霉(Trichodermaharzianum)。P.pastorisGS115和質(zhì)粒pPIC9K均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。重組畢赤酵母pPIC9K-BGN13.1a(PAOX1型畢赤酵母)及pGAP9K-BGN13.1a(PGAP型畢赤酵母)均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[14]。

雜糖，江蘇先卓食品有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、甘油，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 10，胰蛋白胨 20。

重組畢赤酵母pGAP9K-BGN13.1a發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖/雜糖40，酵母粉10，蛋白胨40，MgSO45.7，CaSO40.1，K2SO44.8，KH2PO414.3，(NH4)2SO45，PTM14.8 mL/L，pH 6.0。

重組畢赤酵母pPIC9K-BGN13.1a發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油/雜糖 40，H3PO420 mL/L，CaSO40.1，K2SO418.2，MgSO4·2H2O 14.9，KOH 4.13，PTM14.8 mL/L，pH 6.0。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LCS-5000離子色譜儀，美國戴安公司；ultrafle xtreme型MALDI-TOFMS,美國Bmker Daltonics公司；傅里葉紅外光譜儀，美國高力公司；LC-2010A高效液相色譜儀，日本島津公司；7L發(fā)酵罐，美國Eppendf NBS公司。

1.2 方法

1.2.1 單糖組成分析

雜糖稀釋2倍后，經(jīng)5倍醇沉可去除大部分單糖，再對醇沉后的樣品使用石墨化碳固相萃取柱進(jìn)行分離除去單糖[14]，經(jīng)薄層層析板檢測，單糖被全部去除。稱取去除單糖后樣品0.005 0 g，加入300 μL 2 mol/L的三氟乙酸(CF3COOH)，100 ℃恒溫酸解12 h，氮吹儀吹干，并加入甲醇操作3次除去CF3COOH，將水解產(chǎn)物用超純水溶解后，定容至25 mL，ICS-5000離子色譜儀進(jìn)行色譜分析。色譜柱為CarboPac PA20；洗脫方式為梯度洗脫，流動相為A (超純水)，B (250 mmol/L NaOH)，C (1 mol/L NaAc)。

1.2.2 分子量分布及聚合度分析

基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectro metry, MALDI-MS)可以通過測定離子的質(zhì)荷比(m/z)從而對物質(zhì)的分子量進(jìn)行測定。取樣品約為0.1 mg/mL，吸取樣液1.0 μL加到樣品板上，晾干，樣品與基質(zhì)混合結(jié)晶后進(jìn)行測量。

1.2.3 傅里葉紅外光譜

傅里葉紅外光譜(fourier transform infrared spectrometer, FTIR)是測定物質(zhì)的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜手段。樣品與KBr晶體適量混合后充分研磨，制片，在400～4 000 cm-1對測定樣品進(jìn)行紅外波長掃描。

1.2.4 總糖及主要物質(zhì)含量測定

采用蒽酮硫酸法測定總糖含量。采用高效液相色譜儀測定葡萄糖、果糖、二糖及三糖含量。色譜柱為Hypersil APS2；流動相為70%乙腈；檢測器為RID檢測器。

1.2.5 培養(yǎng)方法

1.2.5.1 搖瓶培養(yǎng)

重組畢赤酵母pGAP9K-BGN13.1a：按接種量4%(體積分?jǐn)?shù))將種子液接入裝有50 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，每隔6 h測定OD600、殘余葡萄糖濃度，最終發(fā)酵液測酶活。

重組畢赤酵母pPIC9K-BGN13.1a：按接種量4%(體積分?jǐn)?shù))將種子液接入裝有50 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，碳源耗盡后，饑餓培養(yǎng)一段時間，每隔24 h補(bǔ)加1%(v/v)甲醇，每隔6 h測定OD600、殘余甘油或葡萄糖濃度，最終發(fā)酵液測酶活。

1.2.5.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

重組畢赤酵母PGAP9K-BGN13.1a：將2.7 L 初始培養(yǎng)基置于7 L發(fā)酵罐內(nèi)，滅菌，接種前調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基使其在30 ℃、pH 6.0穩(wěn)定2 h。加入300 m L的種子液。調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速，維持溶氧量(dissolved oxygen, DO)在10%之上。測定發(fā)酵過程中的OD600及葡萄糖含量，待葡萄糖耗盡后，以6 mL/L/H補(bǔ)加500 g/L葡萄糖或雜糖。

重組畢赤酵母pPIC9K-BGN13.1a：將2.7 L 的初始培養(yǎng)基置于7 L發(fā)酵罐內(nèi)，滅菌，接種前調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基使其在30 ℃、pH 6.0穩(wěn)定 2 h。加入300 mL的種子液。當(dāng)初始碳源耗盡后(DO突然上升，補(bǔ)加少量碳源后DO驟然下降)，開始使用DO-Start程序流加碳源[16]，DO水平維持在20%。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定量后，饑餓培養(yǎng)1～2 h以徹底耗盡殘余甘油或葡萄糖，之后開始進(jìn)行純甲醇誘導(dǎo)。利用甲醇電極在線測量甲醇含量。每隔2～5 h使用氣相色譜法離線測定甲醇含量[17]，維持甲醇質(zhì)量濃度10 g/L直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.6 酶活測定

本研究中內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶活力定義為：以熱凝膠為底物，水解反應(yīng)1 min生成1μg寡糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。

反應(yīng)體系5 mL，包含1.5 mL 20 g/L熱凝膠懸浮液，2.5 mL 醋酸鈉緩沖液(0.025 mol/L，pH 6.0)，1 mL 畢赤酵母發(fā)酵液上清，反應(yīng)液置于50 ℃水浴2.5 h后沸水浴加熱10 min終止反應(yīng)。隨后，水解液中寡糖含量采用薄層層析法測定[18]。

1.2.7 蛋白含量測定

使用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜糖組分分析

2.1.1 單糖組成、分子量及聚合度分析

對二糖以上部分進(jìn)行單糖組成分析，結(jié)果如圖1，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)糖對比分析，證明雜糖二糖以上部分是由葡萄糖單體組成的聚合物。

1-巖藻糖;2-鼠李糖;3-阿拉伯糖;4-半乳糖；5-葡萄糖；6-木糖；7-甘露糖;8-果糖圖1 單糖祖成分析Fig.1 The monosaccharide compositions analysis

利用MALDI-MS表征手段對雜糖的分子量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2。

圖2 雜糖的MALDI-MS質(zhì)譜鑒定Fig.2 The MAOLDI-MS identification of the mixedcarbohydrate

線性葡聚糖的質(zhì)荷比(m/z)=162×n+18+39(MrK) (n表示聚合度)[20]；結(jié)合單糖組成分析的結(jié)果(圖2僅顯示二糖以上質(zhì)譜結(jié)果)，對樣品糖進(jìn)行MALDI-MS 圖譜分析，目標(biāo)核質(zhì)比數(shù)據(jù)顯示雜糖是含有 1～16 個聚合度的線性多糖。

2.1.2 傅里葉紅外光譜

使用紅外光譜法驗(yàn)證雜糖立體構(gòu)型是否發(fā)生改變，如圖3所示， 在3 200～3 600 cm-1處的伸縮振動峰是—OH的特征吸收峰，2 915～2 940 cm-1處的伸縮振動峰吸收峰是—CH的特征吸收峰[21]。在840 cm-1處是α-型糖苷鍵的特征吸收峰。這些結(jié)果表明，雜糖中寡糖均是α-型葡寡糖[22]。

圖3 雜糖的FTIR分析Fig.3 The FTIR spectra of the mixed carbohydrate

2.1.3 總糖及主要物質(zhì)含量

結(jié)合以上分析，雜糖的寡糖部分是聚合度2～16的α-型線性葡聚糖，單糖部分包括葡萄糖和果糖。采用蒽酮硫酸法測總糖，測得雜糖的總糖含量為802.3 g/L。利用HPLC法測定雜糖中單糖、二糖及三糖含量，結(jié)果：葡萄糖480 g/L，果糖92 g/L，麥芽糖103.6 g/L，麥芽三糖36.8 g/L。理論上其可作為優(yōu)質(zhì)的生物發(fā)酵的可替代碳源。

2.2 PAOX1型畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)

2.2.1 發(fā)酵初始碳源含量

PAOX1型畢赤酵母外源表達(dá)過程需要甲醇誘導(dǎo)，是應(yīng)用最廣泛的畢赤酵母之一。發(fā)酵初始碳源含量對發(fā)酵過程有著重要的影響。初始碳源含量過低，發(fā)酵液中營養(yǎng)成分不足，菌株生長緩慢，過高可能會對菌株生長起到抑制作用[23]。選取3個碳源梯度，如圖4所示，初始甘油為20和60 g/L時，菌株生長均被不同程度抑制。相同條件下使用雜糖做碳源時高濃度抑制作用不明顯，但最大生物量與甘油相比低21%左右。

a-甘油作碳源;b-雜糖作碳源圖4 不同初始碳源含量對PAOX1型畢赤酵母生長效果的影響Fig.4 Effects of different initial carbon source contents oncell growth of P. pastoris PAOX1

2.2.2 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

在7 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行放大培養(yǎng),如圖5所示。

a-甘油作碳源;b-雜糖作碳源圖5 7 L發(fā)酵罐水平PAOX1型畢赤酵母發(fā)酵過程圖Fig.5 The batch profiles of P. pastoris PAOX1in 7 L bioreactor

以雜糖為碳源的PAOX1型畢赤酵母發(fā)酵過程與甘油有較大區(qū)別。在生物量方面，雜糖做碳源時最大生物量為59.1 g/L，比甘油的82 g/L低20%左右。進(jìn)入誘導(dǎo)期時間比甘油組晚8 h，且在誘導(dǎo)期幾乎不再生長。對于PAOX1型畢赤酵母，甘油作碳源時菌株生長效果往往優(yōu)于葡萄糖,而雜糖的主要成分為葡萄糖，所以使用雜糖作碳源在PAOX1型畢赤酵母的菌株積累方面與甘油相比不占優(yōu)勢；在誘導(dǎo)期，雜糖為碳源時最高酶活性為157.29 U/mL，比甘油的199.2 U/mL低21%左右，葡萄糖以及低聚寡糖等對AOX1啟動子具有強(qiáng)烈抑制作用[12],盡管經(jīng)過饑餓培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中的葡萄糖已被耗盡，但不排除雜糖中的寡糖對產(chǎn)酶的抑制作用。但考慮到雜糖成本遠(yuǎn)低于甘油，所以雜糖仍可作為PAOX1型畢赤酵母可選擇的生長期碳源。

2.3 PGAP型畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)

2.3.1 發(fā)酵初始碳源含量

GAP啟動子是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中AOX1啟動子的常用替代啟動子之一，其表達(dá)過程不需要甲醇誘導(dǎo)，可以有效利用葡萄糖供菌體生長以及外源蛋白表達(dá)。

如圖6所示，初始葡萄糖為40和60 g/L時生長效果較好，但兩者相差不大。出于經(jīng)濟(jì)性考慮，應(yīng)選取40 g/L的初始葡萄糖含量進(jìn)行發(fā)酵。相同條件下使用雜糖做碳源時生長效果與葡萄糖相當(dāng)，兩者呈現(xiàn)出相似的生長規(guī)律。由此可見，雜糖可被PGAP型畢赤酵母有效利用，供菌體生長。

a-葡萄糖作碳源;b-雜糖作碳源圖6 不同初始碳源含量PGAP型畢赤酵母生長效果的影響Fig.6 Effects of different initial carbon source contentson cell growth of P3 pastoris PGAP

2.3.2 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

在7 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行放大培養(yǎng)。如圖7所示，以雜糖為碳源的PGAP型畢赤酵母發(fā)酵效果與葡萄糖相當(dāng)，最大生物量分別達(dá)到69.3和71.6 g/L，最高酶活分別為180.2和176.5 U/mL。說明本實(shí)驗(yàn)所用雜糖可以作為PGAP型畢赤酵母的優(yōu)質(zhì)替代性碳源生產(chǎn)內(nèi)切β-1,3葡聚糖酶。

a-葡萄糖作碳源;b-雜糖作碳源圖7 7 L發(fā)酵罐水平PGAP型畢赤酵母發(fā)酵過程圖Fig.7 The batch profiles of P. pastoris PGAP in 7 Lbioreactor

3 結(jié)論

雜糖為碳源代替葡萄糖或甘油利用2種不同啟動子調(diào)控的畢赤酵母外源表達(dá)內(nèi)切β-1,3葡聚糖酶。雜糖成分為葡萄糖和果糖以及聚合度為2～16的線性葡聚糖，主要為葡萄糖480 g/L、果糖92 g/L、麥芽糖103.6 g/L、麥芽三糖36.8 g/L、總糖含量為802.3 g/L。以40 g/L的初始碳源質(zhì)量濃度對2株畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在7 L發(fā)酵罐水平，雜糖與葡萄糖在做PGAP型畢赤酵母碳源時發(fā)酵效果相當(dāng)，其可以作為優(yōu)質(zhì)替代性碳源代替葡萄糖；在此條件下，使用雜糖作替代碳源可節(jié)省約37.1元碳源成本。對于PAOX1型畢赤酵母，雜糖做碳源細(xì)胞密度和酶活性與甘油相比均有所下降，最大生物量分別為59.1和82.0 g/L，最高酶活性分別為157.29和199.2 U/mL，在此條件下，使用雜糖作替代碳源可節(jié)省約17.7元碳源成本，但雜糖發(fā)酵效果較差這一現(xiàn)象還有待進(jìn)一步展開相關(guān)研究，以期得到雜糖做PAOX1型畢赤酵母替代性碳源更好的方法。