王方，麻紅太，胡德，鄭淑晶，王淑敏※

（1.長春中醫(yī)藥大學吉林省菌物藥生物技術工程實驗室，吉林 長春 130117；2.吉林省人事考試中心，吉林 長春 130022）

靈芝孢子粉（Ganoderma Lucidum Spores）為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝〔Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.〕或紫芝（Ganoderma sinense Zhao,xu et Zhang）的干燥成熟孢子[1]，是一種極微小的卵形生殖細胞。靈芝孢子粉具有靈芝全部的遺傳物質，且有效成分含量相比于靈芝母體更高[2]，研究證明靈芝孢子粉中含有多糖、三萜[3]、蛋白質、核酸[1]等成分，臨床上多用于抗腫瘤[4]、安神、抗氧化[5]、增強機體免疫力[6]等方面，是一種極為重要的藥食兩用真菌。

近年來，探討破壁靈芝孢子粉的藥理作用及部分化學成分含量的研究較多，但鮮有對破壁前后靈芝孢子粉質量進行對比的報道。靈芝孢子粉作為目前市面上最受歡迎的保健食品之一，其藥用價值毋庸置疑，市場需求量大且價格昂貴，但質量良莠不齊，存在摻偽及造假現象[7]，目前各版藥典及吉林省藥材標準暫無收載靈芝孢子粉的相關質量標準，筆者探究靈芝孢子粉破壁前后的質量差異，以期為指導靈芝孢子粉的規(guī)范化生產和臨床應用提供理論依據。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

試驗所用10 批破壁靈芝孢子粉（P1～P10）和未破壁靈芝孢子粉（W1～W10）藥材均購于吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司，經長春中醫(yī)藥大學王淑敏教授鑒定為多孔菌科真菌赤芝（G lucidum）的干燥成熟孢子。

1.2 儀器

YYS-100E 型生物顯微鏡（上海圓儀光學儀器有限公司）；XL-30 ESEM環(huán)境掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；KQ-500DA 型數控超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；AUY-220 分析天平、AA-6880 原子吸收分光光度計、UV-2450 紫外-可見分光光度計（日本島津有限公司）；GZX-9140MBE 型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；MC02810218 馬弗爐（余姚金電儀表有限公司；HH-6 數顯恒溫水浴鍋兩列三孔（常州市江南實驗儀器廠）；KDM 型調溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；PF-25原子熒光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；TGL 16M 臺式高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；AS 3120A超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.3 試劑

破壁靈芝孢子粉對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號：121701-201401）；無水葡萄糖（天津市光復精細化工研究所，批號：20140221）；齊墩果酸（上海源葉生物科技有限公司，批號：HA0820KA14）；乙醇、硫酸、冰醋酸、高氯酸等均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 炮制方法

取成熟的未破壁孢子粉，去除雜質，采用破壁機機械法破壁，干燥，即得。

2.2 性狀鑒別

未破壁靈芝孢子粉呈淺棕色，較干燥，質地極輕，手捻之有滑膩感，無特殊氣味；

破壁靈芝孢子粉呈深褐色，有潮濕感，偶有結塊，指觸即散，氣微，味微苦。

2.3 顯微鑒別

光學顯微圖見圖1～2，電子顯微圖見圖3～4。

圖1 光學顯微鏡下破壁孢子粉（x40）Fig.1 The broken spore powder under optical microscope(x40)

圖2 光學顯微鏡下未破壁孢子粉（x40）Fig.2 The unbroken spore powder under optical microscope(x40)

圖3 電子顯微鏡下破壁靈芝孢子粉（x5 000）Fig.3 The broken G.lucidumspore powder unde electron microscope（x5 000）

圖4 電子顯微鏡下未破壁靈芝孢子粉（x5 000）Fig.4 The unbroken G.lucidumspore powder unde electron microscope（x5 000）

2.4 TLC鑒別

分別取供試樣品粉末各2 g，加乙醇30 mL，加熱回流30 min，過濾后蒸干濾液，殘渣用2 mL甲醇溶解，即得供試品溶液。取靈芝孢子對照品溶液1 g，同法制得對照品溶液。參照2015年版《中國藥典》四部通則0502 薄層色譜項下方法，吸取對照品溶液和供試品溶液各4L，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干后置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點（圖5）。

圖5 靈芝孢子粉薄層色譜圖Fig.5 Thin layer chromatogram of G.lucidumspore powder

2.5 水分測定

參考2015年版《中國藥典》四部通則0832 項下方法，分別測定10 批次破壁和未破壁孢子粉水分，結果見表1。

2.6 總灰分測定

參考2015年版《中國藥典》四部通則2302 項下方法，分別測定10 批次破壁和未破壁靈芝孢子粉總灰分及酸不溶性灰分含量，結果見表1。

2.7 浸出物測定

參考2015年版《中國藥典》四部通則2201 項下熱浸法，以水為溶劑，分別測定10 批破壁和未破壁靈芝孢子粉浸出物的含量，結果見表1。

表1 10 批破壁與未破壁孢子粉水分、灰分和浸出物含量Table 1 Contents of water,ash and extract in 10 batches of broken and unbroken spore powder （%）

續(xù)表1 （%）

2.8 重金屬含量測定

2.8.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取供試樣品0.3 g，置四乙烯消解罐內，加硝酸10 mL，混勻，浸泡過夜，蓋好內蓋，旋緊外套，置于微波消解爐內消解后（消解程序：0～5 min 100 ℃、5～8 min 100 ℃、8～13 min 150℃、13～16 min 150 ℃、16～21 min 190 ℃、21～51 min 190 ℃），取出消解內罐置于電熱板上，在120 ℃下緩緩加熱至紅棕色蒸氣揮盡，并濃縮至2～3 mL，放冷，轉入25 mL 量瓶中，用超純水洗滌容器，洗液合并于量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻備用。同時按上述方法制備空白溶液。

2.8.2 標準貯備溶液的制備 分別精密吸取銅、鉛、鎘、砷、汞標準溶液適量置于100 mL 容量瓶中，用2%的硝酸稀釋成銅含量為10g/mL，鉛、鎘、砷、汞含量分別為1g/mL標準貯備液，于0～5℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.8.3 標準曲線的繪制及回歸方程的建立 精密吸取銅、鉛、鎘、砷、汞標準貯備液適量，分別置于25 mL 容量瓶中，加入2%硝酸溶液，制備成含銅分別為0、0.05、0.20、0.40、0.60、0.80g/mL，含汞分別為0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 ng/mL，含砷分別為 0、5、10、20、30、40 ng/mL，含鉛分別為 0、5、20、40、60、80 ng/mL，含鎘分別為0、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0 ng/mL的溶液，測定吸光值，以濃度（x）為橫坐標，以對應的吸光值（y）為縱坐標，繪制出相應的標準曲線，以此建立銅元素的線性回歸方程為 y銅=0.175 11x銅+0.000 331 31，r銅=0.999 9；汞元素的線性回歸方程為y汞=1 664.323 8x汞+8.151 3，r汞=0.999 5；砷元素的線性回歸方程為y砷=158.366 1 x砷+10.055 0，r砷=0.999 3；鉛元素的線性回歸方程為 y鉛=0.003 926 4x鉛+0.020 903，r鉛=0.999 6；鎘元素的線性回歸方程為y鎘=0.058 771x鎘+0.008 584 4，r鎘=0.999 3。

2.8.4 重金屬檢測結果 參考《中國藥典》2015年版第四部通則2321 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法第一法——原子吸收分光光度法進行檢測。結果見表2。

表2 10 批次破壁與未破壁孢子粉重金屬含量Table 2 Contents of heavy metals in 10 batches of broken and unbroken spore powder （mg/kg）

續(xù)表2 （mg/kg）

2.9 多糖含量測定

2.9.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，加水配制成含量0.122 mg/mL的溶液，混勻備用。

2.9.2 供試品溶液的制備 精密稱定破壁與未破壁靈芝孢子粉各2 g，分別置于500 mL 圓底燒瓶中，并加超純水60 mL，靜置1 h 后加熱回流4 h，趁熱過濾，將濾渣與濾紙置入燒瓶中，再加超純水60 mL，加熱回流3 h，趁熱過濾，合并2 次濾液，置水浴上蒸干，殘渣溶于5 mL 水中，緩緩加入70 mL 乙醇，搖勻，在4 ℃放置12 h，離心，棄上清，沉淀物用熱水溶解并轉移至50 mL 量瓶中，放冷，以水為溶劑，定容至刻度，搖勻，取適量溶液，離心，精密吸取上清液3 mL，置于25 mL量瓶中，加水至刻度搖勻備用。

2.9.3 波長的選擇 精密吸取對照品溶液、供試品溶液各2 mL，分別置15 mL具塞試管中，各加水至2 mL，迅速加入新配制的硫酸蒽酮溶液6mL，搖勻，靜置15min后，立即置冰水浴中冷卻15 min，取出，空白溶液校正，利用紫外-可見分光光度計于400～800 nm波長內進行掃描，根據試驗結果，對照品和供試品溶液在624 nm波長處有最大吸收，故選擇624 nm 作為試驗波長。

2.9.4 回歸方程的建立 精密吸取對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置15 mL具塞試管中，各加水至2 mL，迅速加入新配制的硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，靜置15min后，立即置冰水浴中冷卻15min，取出，空白溶液校正，于624 nm 波長下測定吸光值，以吸光值（A糖）為縱坐標，濃度（C糖）為橫坐標，繪制標準曲線。線性回歸方程為 A糖=0.065 3C糖0.104 3，r糖=0.999 8，無水葡萄糖在0.048 8～0.097 6 mg 線性關系良好。

2.9.5 精密度 精密吸取對照品溶液1.0mL，置15mL具塞試管中，各加水至2 mL，按“2.9.4”項下方法連續(xù)6 次測定其吸光值，其RSD為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.9.6 重復性 精密吸取2 mL同一批號供試品溶液6 份，分別置15 mL具塞試管中加水至2 mL，按“2.9.4”項下方法測定吸光值，計算靈芝多糖含量。其RSD 為1.15%，表明重復性良好。

2.9.7 穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品溶液 1.0，按“2.9.4”項下方法，分別測定0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 min 時的吸光值，其 RSD 為 0.87%，表明供試品溶液在60 min 內能保持良好的穩(wěn)定性。

2.9.8 加樣回收率 分別精密稱取6 份已知含量的同一批號樣品2 g，加入500 mL 圓底燒瓶中，分別精密加入105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖30 mg，按“2.9.4”項下的方法測定吸光值。計算其平均回收率（101.73%）符合2015年版《中國藥典》所規(guī)定的92%～105%范圍，說明該方法精確度較高。其加樣回收率結果見表3。

表3 加樣回收率Table 3 Recovery rate of added samples

2.9.9 多糖含量測定 精密稱取10 批次破壁和未破壁靈芝孢子粉樣品各2 g，分別按“2.9.2”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.9.4”項下方法測定吸光度，計算靈芝孢子粉的多糖含量。結果見表4。

表4 孢子粉多糖和總三萜含量Table 4 Polysaccharides and total triterpene contents of spore power

2.10 總三萜含量測定

2.10.1 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品適量，加甲醇制成0.2 mg/mL 溶液，混勻備用。

2.10.2 供試品溶液的制備 精密稱取破壁和未破壁靈芝孢子粉各2 g，置于具塞錐形瓶中，并入95%乙醇50 mL，超聲45 min，過濾，濾液置100 mL量瓶中，用適量95%乙醇洗滌濾器和濾渣，并定容至刻度，搖勻備用。

2.10.3 波長的選擇 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各0.2 mL，分別置15 mL 具塞試管中，水浴揮干，放冷，精密加入新配制香草醛-冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70 ℃水浴15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出后精密加入乙酸乙酯4 mL，空白溶液校正，利用紫外-可見分光光度計于400～800 nm 波長內進行掃描，根據試驗結果，對照品和供試品溶液在548 nm 波長處有最大吸收，故選擇548nm 作為試驗波長。

2.10.4 回歸方程的建立 精密吸取對照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分別置15 mL具塞試管中，水浴揮干，放冷，精密加入新配制香草醛-冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70 ℃水浴15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出后精密加入乙酸乙酯4 mL，空白溶液校正于548 nm 波長下測定吸光值，以吸光值（A齊）為縱坐標，濃度（C齊）為橫坐標，繪制標準曲線。線性回歸方程為 A齊=0.035 2 C齊0.103 8，r齊=0.999 6，齊墩果酸在0.02～0.14 mg 線性關系良好。

2.10.5 精密度 精密吸取同一對照品溶液1.0 mL，按“2.10.4”項下方法連續(xù)6 次測定其吸光值，其RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.10.6 重復性 精密稱取同一批號樣品 6 份，按“2.10.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液2 mL，置15 mL具塞試管中，按“2.10.4”項下方法測定其吸光值，計算總三萜含量，其RSD 為1.56%，表明重復性良好。

2.10.7 穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品溶液1.0 mL，按“2.10.4”項下方法分別測定其在 0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 min 時的吸光值，其 RSD 為 0.57%。表明供試品溶液在60 min 內能保持良好的穩(wěn)定性。

2.10.8 加樣回收率 分別精密稱取0.5 g已知含量的同一批號樣品6 份，分別置于具塞錐形瓶中，分別精密加入齊墩果酸標品約3 mg，按“2.10.4”項下方法測定其吸光值。計算總三萜加樣回收率（99.94%），符合2015年版《中國藥典》所規(guī)定范圍（92%～105%），說明該方法精確度較高。加樣回收率結果見表5。

2.10.9 總三萜含量測定 分別精密稱取10 批次破壁與未破壁靈芝孢子粉樣品2.0g，按“2.10.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.10.4”項下方法測定吸光值，計算破壁、未破壁靈芝孢子粉的總三萜含量。結果見表4。

表5 總三萜加樣回收率Table 5 Recovery rate of total triterpenoid added sample

3 討論

本研究通過對10 批破壁與未破壁靈芝孢子粉外觀性狀、顯微鑒別、理化鑒別等方面進行評價，全面探究破壁與未破壁靈芝孢子粉質量差異。

由試驗結果可以得出，對破壁與未破壁靈芝孢子粉鑒別可從以下3 個方面入手：①外觀性狀。靈芝孢子粉破壁后顏色加深，由未破壁時的淺棕變?yōu)樯詈稚雌票阪咦臃垠w輕，有滑膩感，破壁孢子粉體略重，有潮濕感。②顯微觀察。破壁靈芝孢子粉呈不規(guī)則碎片狀，大小不一，可見散落的孢子碎片與內容物；未破壁靈芝孢子粉呈完整卵形，頂端平截，內壁有疣狀突起。③理化鑒別。薄層色譜結果顯示，破壁與未破壁靈芝孢子粉在與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。

破壁與未破壁靈芝孢子粉水分平均含量分別為8.16%、10.77%，破壁靈芝孢子粉水分略低于未破壁靈芝孢子粉，原因可能為未破壁孢子粉外壁是由具有較強親水性的葡聚糖構成，破壁后的孢子粉有疏水的孢子油析出，阻礙葡聚糖對水分的吸收，相同質量下的2種孢子粉，未破壁孢子粉含水量更高。破壁與未破壁孢子粉總灰分平均含量為0.87%、0.64%，酸不溶性灰分平均含量為0.31%、0.16%，破壁孢子粉總灰分與酸不溶性灰分含量高于未破壁孢子粉，其原因主要是孢子粉破壁過程中，某些化學成分發(fā)生改變，不易灰化，但使破壁孢子粉不易灰化的成分及原因尚不清楚。破壁與未破壁孢子粉浸出物平均含量為5.86%、7.48%，可能原因是靈芝孢子粉破壁后，有疏水性孢子油溶出，阻礙靈芝孢子粉中內容物的浸出。相同質量下，未破壁孢子粉浸出物含量大于破壁孢子粉。在測定的5 種重金屬含量中，破壁與未破壁孢子粉結果無較大差異，證明靈芝孢子粉破壁過程對重金屬含量無影響。

臨床實踐證明，多糖與總三萜是靈芝孢子粉中的主要活性物質，起到抗腫瘤、安神、增強機體免疫力等作用。本研究結果顯示，破壁后的靈芝孢子粉多糖平均含量（1.54%）和總三萜平均含量（4.22%）均高于未破壁靈芝孢子粉多糖與總三萜平均含量（0.99%、2.32%）。

綜合試驗結果來看，破壁后的靈芝孢子粉比未破壁孢子粉能夠釋放更多的有效成分，更利于人體吸收，因此認為破壁靈芝孢子粉優(yōu)于未破壁靈芝孢子粉。但破壁后的靈芝孢子粉產生的孢子油，若長時間暴露在空氣中，極易氧化變質，使孢子油酸價變高，產生異味，影響孢子粉的保健效果及口感。因此靈芝孢子粉應注意使用獨立包裝，并在陰涼通風處保存。