王麗霞，王 芳，劉孟宗，趙文華，王晨旭，陸藝菲

(天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

植物精油是一種具有揮發(fā)性植物特有芳香味的油狀液體，其主要來(lái)源于植物的花、葉、根、果實(shí)、種子等部位．陳建煙等[1]研究發(fā)現(xiàn)植物精油成分為萜類化合物、有機(jī)酸和微量元素等物質(zhì)，尤其以單萜類和倍半萜類為主．目前提取植物精油的方法繁多，其中廣泛使用的方法有傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法和溶劑萃取法．傳統(tǒng)方法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易，但是蒸餾過(guò)程中物料長(zhǎng)期處于高溫狀態(tài)，容易造成熱敏性成分分解；溶劑萃取法獲得精油容易將植物里的樹(shù)脂等成分提取出來(lái)導(dǎo)致雜質(zhì)較多[2]．超臨界CO2萃取技術(shù)由于其萃取能力強(qiáng)、得率高、有效成分多、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的青睞，被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥品和保健食品領(lǐng)域[3]．

植物精油成分復(fù)雜而且本身含有多種生物活性，最突出的兩個(gè)特性便是抗氧化活性和抑菌性．抗氧化活性對(duì)人體有重要作用，人類的糖尿病、心血管疾病、腫瘤等疾病都是由于體內(nèi)自由基過(guò)多引起的．Daniel-Jambun等[4]用甲醇提取生姜中的酚類物質(zhì)并測(cè)定了抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)生姜具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并且有效成分為非極性物質(zhì)，親脂性高更易通過(guò)細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用．Wang等[5]研究了肉桂精油中的肉桂醛對(duì)牙齦卟啉菌生長(zhǎng)有抑制作用，通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞膜破裂從而導(dǎo)致核酸和蛋白泄露，最終菌體死亡．本文比較生姜、大蒜、丁香、茴香這4種植物精油的抗氧化活性和抑菌活性，以期篩選出一種抑菌和抗氧化活性均較強(qiáng)的植物精油，作為食品添加劑用于食品行業(yè)，達(dá)到保鮮和抑菌等目的．

1 材料與方法

1.1 材料

選取黃爪姜塊莖、蒲棵紫皮蒜鱗莖、紫丁香花蕾和小茴香果實(shí)經(jīng)過(guò)超臨界萃取獲得植物精油(萃取條件為：萃取壓力 35MPa，萃取溫度 35℃，CO2流量15L/h，萃取時(shí)間 2h)．

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E. coli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和青霉(Penicillium)由天津科技大學(xué)菌種保藏中心提供．

抗壞血酸(VC)、1，1–二苯基–2–三硝基苯肼(DPPH)、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵均為國(guó)產(chǎn)分析純；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基均為生化試劑．

SP–2102UV 型紫外–可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；DZF–6020型恒溫培養(yǎng)箱，上海益恒科技有限公司；LS–B50LB50L型立式壓力蒸氣滅菌器，上海?，攲?shí)驗(yàn)有限公司；GCMS–QP2010Ultra型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)瓦里安技術(shù)有限公司．

1.2 調(diào)味料精油的成分分析

參照白娟[6]氣質(zhì)條件，運(yùn)用 GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì) 4種調(diào)味料精油進(jìn)行定性、定量分析，通過(guò)質(zhì)譜圖庫(kù)檢索確定精油成分．

1.3 調(diào)味料精油抗氧化活性的測(cè)定

1.3.1 調(diào)味料精油對(duì)DPPH自由基(DPPH·)的清除

移取 2.0mL不同濃度的植物精油于具塞試管中，加入 2.0mL DPPH乙醇溶液(DPPH濃度為0.2mmol/L)，充分振蕩混合均勻，放置具塞試管在黑暗中避光 30min，反應(yīng)結(jié)束后使用酶標(biāo)儀測(cè)量其在517nm處的吸光度．為消除試劑本身顏色對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，同時(shí)測(cè)定2.0mL DPPH乙醇溶液與2.0mL乙醇混合后的溶液的吸光度，以及同樣反應(yīng)體積的各種精油與 2.0mL無(wú)水乙醇混合后溶液的吸光度[7]．選用VC作陽(yáng)性對(duì)照．DPPH·清除率按照式(1)計(jì)算．

式中：A0為無(wú)水乙醇與 DPPH混合溶液的吸光度；A為精油與 DPPH混合溶液的吸光度；A1為各濃度精油與乙醇混合溶液的吸光度．

心肌肌鈣蛋白的分析問(wèn)題:心肌損傷后cTn釋放入血液循環(huán)需要一定時(shí)間，cTn水平到達(dá)峰值后逐漸下落。在癥狀發(fā)作初期，cTn檢查結(jié)果與樣本采集時(shí)間密切相關(guān)。因此，不能因cTn變化較小而判定為心肌梗死。同時(shí)，許多并發(fā)癥也可導(dǎo)致患者基線cTn數(shù)值(特別是hs-cTn數(shù)值)上升，需引起注意。此外，圍術(shù)期不同時(shí)間cTn的變化情況可用于鑒別急、慢性事件。

向試管中分別加入4.5mL pH 5.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖液和1.0mL試樣溶液，搖勻后25℃恒溫水浴，同時(shí)將 3mmol/L鄰苯三酚溶液(用10mmol/L HCl溶液配制)放在相同溫度下預(yù)熱，反應(yīng)20min后立即加入0.3mL已經(jīng)在水浴中經(jīng)過(guò)加熱的鄰苯三酚溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng) 5min后加 4滴10mol/L HCl終止反應(yīng)．測(cè)定其在 325nm處的吸光度．用 4.2mL的蒸餾水代替樣品液作為空白管，以Tris-HCl緩沖液作空白調(diào)零，各濃度試樣液用以各自反應(yīng)管的調(diào)零[8]．選用VC作陽(yáng)性對(duì)照．清除率按照式(2)計(jì)算．

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為樣品吸光度．

1.3.3 調(diào)味料精油對(duì)羥基自由基(·OH)的清除

在具塞比色管中分別加入 2.0mL FeSO4溶液(1mmol/L)、1.0mL H2O2溶液(2mmol/L)和 3.0mL(6.0mmol/L)水楊酸溶液，搖勻，37℃恒溫水浴15min，測(cè)定反應(yīng)后溶液在510nm下的吸光度．然后向試管中各自再加入 1.0mL不同濃度精油溶液，振蕩混合均勻后，再次恒溫水浴反應(yīng) 15min，反應(yīng)完成后，分別對(duì)各溶液在 510nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)定.空白管不加 H2O2溶液，用 2.0mL蒸餾水代替，按上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定最終反應(yīng)液的吸光度[9].選用VC作陽(yáng)性對(duì)照．·OH清除率按照式(3)計(jì)算．

式中：A0為未加入試樣的吸光度；A1為加入試樣的吸光度；A2為未加入H2O2的吸光度．

1.4 調(diào)味料精油抑菌活性的測(cè)定

1.4.1 抑菌圈直徑

采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)調(diào)味料精油抑菌活性進(jìn)行測(cè)定[10]．將已經(jīng)活化好的菌種接種于液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)使其數(shù)目級(jí)達(dá)到106～108，制備菌懸液以備后用．移取 100μL菌懸液于滅菌后的培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻，再將直徑為6mm的濾紙片置于平板表面．移取20μL植物油于濾紙片上使其滲透均勻，加藥后將平板置于相應(yīng)溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)．

1.4.2 最小抑菌濃度與最小殺菌濃度

最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)采用二倍數(shù)稀釋法進(jìn)行測(cè)定．以 DMSO為溶劑，配制不同質(zhì)量濃度的植物精油，在無(wú)菌試管中加入 10mL滅菌的液體培養(yǎng)基、100μL菌懸液、0.1mL植物精油，在最適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 36h，以不渾濁試管的最小試樣濃度為最小抑菌濃度(MIC)．將試管混合液移取 100μL均勻涂布于平板上，培養(yǎng) 24h后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，以無(wú)菌生長(zhǎng)情況為最小殺菌濃度(MBC)．

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 調(diào)味料精油成分分析

對(duì)生姜精油、大蒜精油、丁香精油和茴香精油的成分進(jìn)行了分析，文中共截取了 25種主要成分，結(jié)果見(jiàn)表1—表4．由表1可知生姜精油揮發(fā)性成分主要是一些單萜和倍半萜類物質(zhì)，其中相對(duì)含量最高的成分是姜烯，含量為 19.57%；其次為α–姜黃烯，含量為 7.51%；姜酮和 6–姜酚分別為 5.51%和 2.91%.Mesomo等[11]使用超臨界萃取的生姜精油主要成分為α–姜烯、β–倍半水芹烯、α–姜黃烯、α–金合歡烯、β–甜沒(méi)藥烯和香茅醛．

表1 生姜精油成分分析Tab. 1 Major chemical composition of ginger essential oil

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)大蒜揮發(fā)油成分主要是含硫化合物和成環(huán)烯烷類．二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚和二烯丙基四硫醚都是大蒜精油主要成分．

對(duì)丁香揮發(fā)油成分分析發(fā)現(xiàn)：其揮發(fā)油組分主要為倍半萜烯和酚類物質(zhì)，其中主要成分丁香酚相對(duì)含量為 85.82%；α和 β 葎兩種類型的 草烯含量都較高，分別為 2.17%、8.74%．González-Rivera等[12]分析了水蒸氣蒸餾獲得的丁香油成分，其中丁香酚含量為66.90%，石竹烯含量為 24.80%，葎草烯和乙酸丁香酚酯含量分別為3.10%和2.70%．

表2 大蒜精油成分分析Tab. 2 Major chemical composition of garlic essential oil

表3 丁香精油成分分析Tab. 3 Major chemical composition of clove essential oil

對(duì)超臨界萃取的茴香油運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)其成分進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：茴香油主要成分為茴香腦(81.17%)、對(duì)烯丙基茴香醚(4.59%)、小茴香酮(1.49%)和檸檬烯(1.13%)．Díaz-Maroto 等[13]研究由同步蒸餾和超臨界萃取兩種方法獲得的茴香精油成分一致，主要成分為反式茴香腦、對(duì)烯丙基茴香醚和茴香酮．但是兩者的相對(duì)含量仍有較大差別．

表4 茴香精油成分分析Tab. 4 Major chemical composition of fennel essential oil

4種精油成分復(fù)雜，但共有一些相同成分，如蒎烯、欖香烯、石竹烯、松油醇等化合物．α–蒎烯在生姜精油和茴香精油中的含量分別為 0.82%和0.50%．生姜精油和茴香精油中都檢測(cè)出松油醇，其中生姜精油是α–松油醇，含量為 0.24%；茴香精油中的是 β–松油醇，含量為 0.10%．欖香烯在生姜精油、丁香精油和茴香精油中含量分別為 1.33%、0.01%和0.10%．

2.2 調(diào)味料精油對(duì)DPPH·的清除活性

4種調(diào)味料精油對(duì) DPPH·的清除活性如圖 1所示．由圖 1可知：在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，調(diào)味料精油清除 DPPH·能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到200μg/mL時(shí)，丁香精油和茴香精油清除率分別為 62.72%、53.85%；當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增加到250μg/mL時(shí)，生姜、大蒜、丁香、茴香精油對(duì)DPPH·的清除率分別為 60.43%、30.77%、74.26%、67.95%．當(dāng)VC質(zhì)量濃度為 150μg/mL時(shí)，清除率已超過(guò) 80%，說(shuō)明其具有良好的抗氧化能力．當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到 200μg/mL時(shí)丁香精油、茴香精油、生姜精油和VC對(duì)DPPH·清除率相差不大．4種植物精油均對(duì)DPPH·有不同程度的清除能力，綜合來(lái)看精油清除能力從大到小依次為丁香精油、茴香精油、生姜精油、大蒜精油．實(shí)驗(yàn)結(jié)果中丁香精油對(duì) DPPH·清除能力最強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉萬(wàn)臣[14]的研究結(jié)果一致，其原因是采用超臨界萃取獲得的丁香精油中含有大量的丁香酚，酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，故而丁香精油本身清除DPPH·能力較強(qiáng)．

圖1 不同調(diào)味料精油對(duì)DPPH·的清除活性Fig. 1 Activity of DPPH· scavenging of different essen-tial oils

2.3 調(diào)味料精油對(duì)的清除活性

圖2 不同調(diào)味料精油對(duì)的清除活性Fig. 2 Superoxide anion radical scavenging of different essential oils

2.4 調(diào)味料精油對(duì)·OH的清除活性

4種調(diào)味料精油對(duì)·OH的清除活性如圖 3所示．由圖 3可知：4種調(diào)味料精油對(duì)·OH均具有較強(qiáng)的清除能力并且清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加．當(dāng)精油質(zhì)量濃度為 50μg/mL時(shí)，生姜、大蒜、丁香、茴香精油清除·OH 的清除率依次為13.66%、3.55%、23.57%、6.72%．當(dāng)質(zhì)量濃度為200μg/mL時(shí)，丁香對(duì)·OH 清除率達(dá)到 53.41%，生姜精油對(duì)其清除率為 34.83%，大蒜精油和茴香精油清除率分別為 22.84%和 27.53%．觀察 VC對(duì)·OH清除能力，除了質(zhì)量濃度為 50μg/mL清除率僅為 12.77%低于生姜精油和丁香精油的清除率，其余質(zhì)量濃度指標(biāo)均高于實(shí)驗(yàn)組．4種調(diào)味料超臨界精油對(duì)·OH清除能力從大到小依次為丁香、生姜、茴香、大蒜. Fujisawa等[15]發(fā)現(xiàn)丁香精油中的丁香酚物質(zhì)在抗氧化方面發(fā)揮了重要作用，主要由于丁香酚中不飽和雙鍵能夠貢獻(xiàn)酚氫原子，從而具有抗氧化活性．Mi等[16]說(shuō)明生姜精油能夠作為自由基清除劑應(yīng)用于食品工業(yè)中，主要緣于生姜中的酚類物質(zhì)如姜酚、姜烯酚等能夠給電子或氫原子，并且能夠捕捉自由基，從而終止過(guò)氧化鏈反應(yīng)機(jī)制．

圖3 不同調(diào)味料精油對(duì)·OH的清除活性Fig. 3 Hydroxyl free radical scavenging of different essential oils

2.5 調(diào)味料精油的抑菌活性

采用瓊脂擴(kuò)散法研究調(diào)味料精油對(duì)于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E. coli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和青霉(Penicillium)的抑菌活性．以抑菌圈直徑、MIC、MBC指標(biāo)評(píng)定調(diào)味料精油對(duì)測(cè)試菌種的抑菌作用，結(jié)果見(jiàn)表5—表7．

表5 調(diào)味料精油的抑菌圈直徑Tab. 5 Inhibition zone diameters of essential oils

從表 5可以看出：調(diào)味料精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、根霉、黑曲霉和青霉都有不同程度的抑制作用．其中，大蒜精油對(duì)青霉抑制作用最強(qiáng)抑菌圈直徑為(29.25±0.17)mm，其次為根霉和黑曲霉．茴香精油對(duì)青霉的抑制效果最好，在測(cè)試濃度中青霉被完全抑制生長(zhǎng)，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最不明顯，抑菌圈直徑為(9.05±0.13)mm．然而生姜精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其抑菌圈直徑達(dá)(27.35±0.17)mm，對(duì)霉菌抑制作用比對(duì)細(xì)菌抑制作用較弱，抑菌圈直徑小于 16mm．根霉對(duì)丁香精油比較敏感，其抑菌圈直徑為(27.30±0.07)mm．每種精油對(duì)細(xì)菌和真菌抑制作用不同，大蒜精油及茴香精油對(duì)真菌的抑制作用大于對(duì)細(xì)菌抑制作用，細(xì)菌對(duì)生姜精油和丁香精油更為敏感．抑菌實(shí)驗(yàn)中精油對(duì)實(shí)驗(yàn)菌種抑菌圈直徑均大于 9mm，所以調(diào)味料精油對(duì)測(cè)試菌種均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用．

表6 調(diào)味料精油的最小抑菌濃度Tab. 6 MIC of essential oils μg/mL

表7 調(diào)味料精油的最小殺菌濃度Tab. 7 MBC of essential oils μg/mL

從表6和表7中發(fā)現(xiàn)：精油品種不同對(duì)不同菌種的最小殺菌濃度和最小抑菌濃度也有所不同．金黃色葡萄球菌對(duì)生姜精油最為敏感，最小抑菌濃度為15.25μg/mL；生姜精油對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最好，最小殺菌質(zhì)量濃度為 40μg/mL．在測(cè)試菌種中，丁香對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌質(zhì)量濃度為 16.75μg/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度為40μg/mL．MIC和MBC數(shù)據(jù)與抑菌圈直徑數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致，說(shuō)明所選精油的抑菌活性較好，有潛力作為食品防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)中．精油能滲透進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的磷脂雙分子層，通過(guò)作用于微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞膜形態(tài)發(fā)生改變，如出現(xiàn)褶皺、凹陷、破裂等現(xiàn)象，破碎的細(xì)胞膜使其滲透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物流出，最終致使菌體死亡[17-19]．

3 結(jié) 語(yǔ)