吳子溫 路運(yùn)才

摘 要：簡單重復(fù)序列作為第二代分子標(biāo)記技術(shù)，在農(nóng)作物分子輔助育種、種質(zhì)資源鑒定等方面得到了廣泛的應(yīng)用。該文介紹了SSR標(biāo)記引物開發(fā)及其原理，并對SSR標(biāo)記在玉米種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、雜交種種子純度鑒定以及雜種優(yōu)勢種群劃分等方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨在為推進(jìn)精準(zhǔn)育種、縮短育種周期等提供參考。

關(guān)鍵詞：玉米;簡單重復(fù)序列;分子標(biāo)記;標(biāo)記輔助育種

中圖分類號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2020）（02-03）-0013-04

當(dāng)前，玉米作為糧飼兼用型作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了不可取代的作用，并在飼料、工業(yè)等方面也有一定的應(yīng)用[1-2]。截至2012年，我國玉米總產(chǎn)量超過了谷類產(chǎn)量，成為我國第一大糧食作物。而當(dāng)前，我國玉米遺傳育種仍是以傳統(tǒng)常規(guī)育種為主，這種育種方式主要依據(jù)表型性狀的觀察，容易受到外界因素的影響。近年來，隨著B73、Mo17等骨干玉米自交系基因組序列的公布，SSR等分子標(biāo)記技術(shù)在玉米遺傳育種方面得到了廣泛的應(yīng)用[3]。

1 SSR引物開發(fā)

隨著引物開發(fā)軟件的不斷更新，不同物種引物設(shè)計(jì)的軟件各不相同。在玉米引物開發(fā)上常用軟件有Primer5.0、Oligo7、DNAsis等。NCBI、MaizeGDB等網(wǎng)站的BLAST選項(xiàng)中找到候選引物的原始序列，通過原始序列可對候選引物重新設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的原則：候選引物長度最好在15～30、堿基的分布應(yīng)符合隨機(jī)性、候選引物序列中不可出現(xiàn)互補(bǔ)序列?，F(xiàn)如今，MaizeGDB已經(jīng)公開的玉米SSR引物約有2000對。SSR核心序列引物的來源有以下3個(gè)：（1）利用SSR序列兩翼的保守序列，在基因文庫中搜索選擇出所需引物序列;（2）微衛(wèi)星富集法[4];（3）利用計(jì)算機(jī)軟件對核苷酸數(shù)據(jù)庫中選擇的引物進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。對所獲得的引物用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，所擴(kuò)增出來目的片段的長短，取決于引物重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)。利用瓊脂糖凝膠電泳，將所擴(kuò)增出來的微衛(wèi)星片段進(jìn)行觀察比較。楊珊等[5]利用20份自交材料的24個(gè)SSR引物中篩選出了4個(gè)對玉米耐鹽堿性相關(guān)的SSR引物。李余良等[6]從玉米基因數(shù)據(jù)庫中開發(fā)了251對SSR引物，電泳檢測出12對關(guān)于雌穗發(fā)育差異的SSR引物多態(tài)性高。

2 SSR標(biāo)記的原理與特點(diǎn)

SSR標(biāo)記技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)發(fā)展起來的第二代分子標(biāo)記技術(shù)。SSR是由1～6個(gè)單核苷酸為重復(fù)單元串聯(lián)在一起，在高等生物中均有SSR存在。然而，每個(gè)SSR序列的核心序列具有相同結(jié)構(gòu)單元，在玉米基因組中常見的二核苷酸重復(fù)單元是（AC）n和（GA）n，這些重復(fù)單元以首尾相連的形式串聯(lián)在一起，一般重復(fù)單元多為10～50個(gè)。SSR核心序列重復(fù)次數(shù)與該座位上的等位基因具有強(qiáng)烈的正相關(guān)性。不同數(shù)目重復(fù)單元串聯(lián)在一起是生物高度多態(tài)性形成的主要原因。限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）可以隨機(jī)選擇酶切位點(diǎn)，但是DNA探針選擇是比較困難[7]。隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性DNA（RAPD），該方法檢測所需時(shí)間與之相比有所縮減，需要的DNA樣品較少，但是該方法共顯性差并且存在著共遷移的問題。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）雖說在穩(wěn)定性和效率上有了一定的改善，但是實(shí)驗(yàn)所需費(fèi)用與之相比并沒有減少，對一些堿基差異較大但分子量相同的片段識(shí)別能力較差。綜合以上幾種標(biāo)記方法，簡單重復(fù)序列（SSR）有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）在真核生物基因組中均有分布，特別在高等生物中分布隨機(jī)且廣泛[8-9];（2）做SSR標(biāo)記時(shí)，對DNA的需求量較少;（3）遵循原始遺傳特性，具有共顯性的特點(diǎn)[10];（4）做PCR分析時(shí)，對DNA的要求不高，盡管DNA已經(jīng)出現(xiàn)了一定的降解，但是對測量結(jié)果也無影響;（5）設(shè)計(jì)的引物序列不同，決定了其相對應(yīng)的等位基因不同的位點(diǎn)，這樣可以方便交流，共同開發(fā)不同的引物[11]。

3 SSR標(biāo)記在玉米中的應(yīng)用

3.1 遺傳多樣性分析 中國是玉米種植大國，品種類型十分豐富，包括普通玉米品種、糯玉米品種、飼用玉米品種等[12]。王鳳格等利用SSR標(biāo)記對328份玉米品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)近年來育成品種遺傳多樣性指數(shù)在不同年份間變化不大，東華北及黃淮海地區(qū)存在品種同質(zhì)化問題[13]。研究現(xiàn)有不同種質(zhì)（品種）的遺傳多樣性，對深入剖析及挖掘優(yōu)異品種的基因組成和提高育種效率具有重要的理論和實(shí)踐意義[14-15]。關(guān)于我國種質(zhì)資源情況，姚杰等[16-17]對我國的種質(zhì)資源進(jìn)行了搜集整理。分子標(biāo)記的出現(xiàn)為遺傳多樣性分析提供了新的方法。近幾年來，國內(nèi)外學(xué)者對于SSR標(biāo)記在玉米遺傳育種上的應(yīng)用開展了大量研究。例如，Zhu等[18]采用SSR標(biāo)記技術(shù)對貴州的21份玉米進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，利用20對引物檢測到了97個(gè)基因變異位點(diǎn)，在參與實(shí)驗(yàn)的21份玉米材料間平均遺傳距離為0.43。Zheng等[19]采用SSR標(biāo)記技術(shù)依托于UPGMA法進(jìn)行了聚類分析，可將165份糯玉米材料劃分為3大類群。張海劍[20]對玉米的彎孢葉斑病進(jìn)行遺傳多樣性分析，為了解不同年份，不同地區(qū)的差異，該課題組進(jìn)行2年多點(diǎn)取樣，并利用篩選出13條引物對175個(gè)月彎孢菌做PCR擴(kuò)增，得到多態(tài)性較高的條帶105條。利用聚類分析法可將該菌分為2群5個(gè)亞群。劉洋等[21]對熱帶44份甜玉米作物的耐旱性進(jìn)行篩選，對葉長、百粒重、株高等表型性狀進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，在這44份材料中只有4份材料表型性狀優(yōu)良，耐旱性較強(qiáng)。張鵬等[22]利用SSR熒光標(biāo)記法對云南省的玉米材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，在30對SSR引物對42份材料檢測出了277個(gè)基因變異，每個(gè)位點(diǎn)平均檢測出9.2個(gè)等位基因。李勤等[23]為了解巴山地區(qū)玉米的遺傳多樣性，利用SSR引物對26份玉米材料進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明，檢測到212個(gè)等位變異，每對引物可檢測到8.83個(gè)等位變異。蒙祖慶[24]對西藏地區(qū)玉米地方品種與外地品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，經(jīng)過2地玉米實(shí)驗(yàn)對比表明，西藏地區(qū)玉米的基因多樣性明顯高于國內(nèi)其他地區(qū)?？梢?，SSR分子標(biāo)記對明確玉米種質(zhì)資源遺傳的多樣性、玉米育種材料的選擇以及種質(zhì)資源創(chuàng)新做出了重大貢獻(xiàn)。

3.2 構(gòu)建玉米DNA指紋圖譜 開發(fā)適用于植物品種SSR指紋分析軟件工具Genemapperhe和Genemarker，實(shí)現(xiàn)了植物品種SSR指紋分析的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化[25]。DNA指紋鑒定類型包括自交系的溯祖、真實(shí)性鑒定、派生關(guān)系的鑒定。在農(nóng)作物品種審定登記制度實(shí)施以來，審定品種數(shù)量呈現(xiàn)了“井噴式”的增長。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，我國玉米的進(jìn)口量逐年增加，新品種相對較少，需求量低于供給量[26]。現(xiàn)階段面臨的現(xiàn)狀是新品種的選育同質(zhì)化過于嚴(yán)重，導(dǎo)致玉米品種遺傳基礎(chǔ)狹窄;所育成的新品種與原有品種性狀相似，很難區(qū)別品種之間的差異[27]。因此，玉米DNA指紋圖譜構(gòu)建成為了迫切的需求，玉米DNA指紋圖譜構(gòu)建對種質(zhì)資源鑒定、育種者維權(quán)、純度分析起到了重大作用。構(gòu)建指紋圖譜依據(jù)是每一個(gè)品種DNA組成不同，構(gòu)建指紋圖譜所選用的DNA帶譜相對穩(wěn)定，不受環(huán)境條件和地理?xiàng)l件的影響，所形成的數(shù)據(jù)庫可納入計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行系統(tǒng)式管理。玉米新品種所形成的DNA指紋庫，可以為人們提供豐富、有價(jià)值的遺傳信息[28]。王鳳格等[29]利用篩選出的40對SSR核心引物對3998份中國審定的品種建立了DNA指紋庫。邱洪波等[30]從34對核心引物中的6對引物建立起了喀斯特山區(qū)的指紋圖譜。邸仕忠等[31]從重慶市66個(gè)玉米自交系幾百對引物中，最終挑選出重復(fù)性較高的10對核心引物，完成了對重慶市66個(gè)玉米自交系的指紋圖譜構(gòu)建。劉濤等[32]、蓋樹鵬等[33]、吳渝生等[34]分別完成了黔東南地區(qū)、山東省、云南省骨干親本的指紋圖譜的構(gòu)建。

3.3 雜交種種子純度的鑒定 種子純度是指種子在種植后所表現(xiàn)出來表型特征和生理生化指標(biāo)的一致性，并且種子純度的高低對種子質(zhì)量的好壞起到了決定性作用[35-37]。玉米雜交種純度的鑒定方法分為外在表型和生理生化指標(biāo)2種，而所鑒定的對象一般是大田生產(chǎn)所用的未登記和審定的實(shí)驗(yàn)用種。外在表型鑒定包括對種子、幼苗和成年植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定。這是我國使用最廣泛的方法，具有直觀、方便、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，但是目前我國育種同質(zhì)化比較嚴(yán)重，導(dǎo)致不同品種間的農(nóng)藝性狀差異小，這對表型性狀的鑒定造成了嚴(yán)重影響[38]。生化鑒定法包括同工酶鑒定和DNA分子標(biāo)記鑒定2種。同工酶電泳法具有受環(huán)境因素影響小、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。Yu等[39]利用玉米雜交種對酯酶同工酶進(jìn)行了鑒定，并取得了良好的成果。近幾年來，隨著對分子生物學(xué)的了解越來越透徹，SSR標(biāo)記在水稻[40]、西瓜[41]和玉米上也得到了廣泛的應(yīng)用。閆米閣等[42]將玉米雜交種強(qiáng)盛16、強(qiáng)盛9、強(qiáng)盛62的SSR引物選擇出來，利用SSR標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確有效的鑒定出了以上4個(gè)品種的純度。李群等[43]選擇9對引物在玉米雜交種登海11號(hào)和其父母本上進(jìn)行試驗(yàn)，選擇出了玉米雜交品種登海11號(hào)種子純度鑒定的引物位點(diǎn)。李曉輝等[44]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對挑選出220對引物，通過電泳進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)選擇出了58對引物用于13個(gè)雜交種種子純度鑒定，結(jié)果表明，該方法可以將13個(gè)雜交種一一區(qū)分開。從常規(guī)鑒定和生化鑒定2個(gè)方面闡明了玉米雜交種純度鑒定的方法，得出了SSR分子標(biāo)記是目前種子純度鑒定最適宜的方法[45]。

3.4 劃分玉米雜種優(yōu)勢種群 雜種優(yōu)勢群是指子一代個(gè)體匯集了父母本的所有有利基因，群間自交系雜交，時(shí)往往可以將父母本的有利基因匯集在一起[46]。研究雜種優(yōu)勢種群關(guān)系對我國玉米種質(zhì)資源的改良具有重要的意義[47]。祁志云等[48]以不同類群測驗(yàn)種自育自交系及美國種質(zhì)共24份，采用不完全雙列雜交設(shè)計(jì)，對供試材料進(jìn)行了雜種優(yōu)勢群劃分，結(jié)果表明，群間特殊配合力大于群內(nèi)特殊配合力。駢躍斌等[49]為了解32份玉米自交系的雜種優(yōu)勢群的分類情況，按照UPGMA的方法對32份自交材料進(jìn)行了聚類分析，將供試的32份自交系材料分為4個(gè)大類群。從雜種優(yōu)勢的實(shí)踐上來看，雙親不屬于同一類群的雜交種體現(xiàn)出了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn)，而雙親屬于同一類群的雜交種未體現(xiàn)出這一特性。許崇香等[50]對黑龍江省的25個(gè)自交系進(jìn)行了雜種優(yōu)勢種群的劃分，通過UPGMA方法做聚類分析，可以將25份自交系材料分為4大類群。杜青等[51]等對廣西省的33份骨干自交系進(jìn)行了雜種優(yōu)勢群的劃分，用已挑選的60對引物對33份自交系玉米進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，廣西省的自交系來源多且遺傳多樣性好，雜種優(yōu)勢種群劃分對雜種優(yōu)勢的利用起到了重大作用[52]。

4 展望

SSR標(biāo)記技術(shù)是近幾年發(fā)展起來理想的標(biāo)記技術(shù)，具有巨大的應(yīng)用前景。隨著玉米基因組學(xué)的迅猛發(fā)展及分子育種實(shí)踐的持續(xù)深入，SSR標(biāo)記技術(shù)將會(huì)得到快速發(fā)展與改進(jìn)[53-55]。SSR標(biāo)記技術(shù)的深入應(yīng)用，方便了育種者從分子層次上揭示表型性狀與基因之間的關(guān)系。隨著育種家們對SSR標(biāo)記技術(shù)的運(yùn)用日益熟練，開展了對玉米新抗逆基因的探索、種質(zhì)資源的高效評(píng)價(jià)和高飽和度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。但是，SSR標(biāo)記所臨的問題是開發(fā)新的SSR引物投入高、難度相對較大并且在構(gòu)建玉米高密度遺傳圖譜時(shí)需要引入其他的標(biāo)記技術(shù)。但未來隨著科學(xué)家們對SSR標(biāo)記技術(shù)運(yùn)用程度的逐步加深，SSR標(biāo)記技術(shù)面臨的難題將會(huì)被逐一攻破。

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（責(zé)編：張宏民）