郭琦，汪靜，曾潔，易喜連，周偉燕，趙海建，張傳寶

(1.北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學(xué)中心 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心，北京100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京100730)

堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)是臨床實(shí)驗(yàn)室重要的檢測項(xiàng)目。國際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)已于2002年、2011年分別發(fā)布了LDH和ALP的參考測量程序，并推薦廠家試劑校準(zhǔn)品量值溯源至酶學(xué)參考系統(tǒng)。目前，酶校準(zhǔn)品的制備有以下幾種方式:基因工程，如羅氏、和光等；提取動(dòng)物組織，如貝克曼等；還有直接使用人血清制備，如德賽等。

據(jù)國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心(NCCL)2012—2016年正確度驗(yàn)證計(jì)劃結(jié)果顯示，以3.23%作為精密度的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，ALP精密度合格率超過85%；然而，以6.72%為偏倚評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，ALP偏倚的通過率小于50%，其中貝克曼的偏倚通過率為25.0%～61.8%、羅氏的偏倚通過率為7.2%～27.5%，不同實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果差異較大[1]。酶學(xué)項(xiàng)目常規(guī)方法的量值溯源通過校準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)，校準(zhǔn)需要注意校準(zhǔn)品量值溯源的有效性，其中復(fù)溶方式會(huì)對量值溯源產(chǎn)生一定影響。本研究主要考察不同酶校準(zhǔn)品復(fù)溶方式對檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1血清樣品 21份單人份血清樣品(HIV抗體陰性，每份0.5 mL)由北京醫(yī)院提供。

1.1.2試劑 貝克曼(Beckman)、羅氏(Roche)、德賽(Diasys)、和光(Wako)的ALP和LDH活性測定試劑盒及其配套校準(zhǔn)品，分別用B、R、D、W代表。試劑與校準(zhǔn)品相關(guān)信息見表1。

表1 試劑盒和校準(zhǔn)品信息

1.1.3校準(zhǔn)品 用移液管分別準(zhǔn)確吸取5 mL去離子水加入3個(gè)校準(zhǔn)品瓶，顛倒校準(zhǔn)品瓶3次，放置10 min，為消除瓶間差，將3個(gè)校準(zhǔn)品瓶的校準(zhǔn)液混合。然后重新分裝到3個(gè)校準(zhǔn)品瓶中，其中2個(gè)校準(zhǔn)品瓶在滾筒混勻器上(25 ℃)放置30 min。隨后取數(shù)支在4 ℃放置至少2 h，記為B0(貝克曼標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品)；另取數(shù)支放置于4 ℃ 0.5 h、1 h、3 h，分別記為B-4-0.5、B-4-1、B-4-3；另取數(shù)支放置于25 ℃ 0.5 h、1 h、2 h、3 h，分別記為B-25-0.5、B-25-1、B-25-2、B-25-3；從另一瓶未在滾筒混勻器上放置30 min的校準(zhǔn)品瓶中取數(shù)支放置于4 ℃ 0.5 h、2 h，分別記為B-4-0.5-N、B-4-2-N。對于羅氏校準(zhǔn)品，用移液管分別準(zhǔn)確吸取3 mL去離子水加入3個(gè)校準(zhǔn)品瓶，顛倒校準(zhǔn)品瓶數(shù)次，將校準(zhǔn)品瓶內(nèi)的校準(zhǔn)液混合，取數(shù)支在25 ℃放置0.5 h，記為R0(羅氏標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品)；另取數(shù)支在4 ℃分別放置0.5 h、1 h、2 h、3 h，分別記為R-4-0.5、R-4-1、R-4-2、R-4-3；另取數(shù)支在25 ℃分別放置1 h、2 h、3 h，分別記為R-25-1、R-25-2、R-25-3。以同樣的方式復(fù)溶德賽和和光校準(zhǔn)品，取數(shù)支放置在25 ℃ 2 h，記為D0(德賽標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品)，取數(shù)支放置在25 ℃ 0.5 h，記為W0(和光標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品)，其余放置在相應(yīng)條件下，分別記為D-4-0.5、D-4-1、D-4-2、D-4-3、D-25-0.5、D-25-1、D-25-3，W-4-0.5、W-4-1、W-4-2、W-4-3、W-25-1、W-25-2、W-25-3。

1.1.4儀器 貝克曼AU5400、日立7180全自動(dòng)生化分析儀，羅氏、德賽、和光方法均根據(jù)廠家推薦的參數(shù)設(shè)置表在日立7180全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)置參數(shù)。

1.2方法

1.2.1挑選待評校準(zhǔn)品 分別用B0、R0、D0、W0對方法進(jìn)行校準(zhǔn)，檢測不同復(fù)溶方式下的貝克曼校準(zhǔn)品ALP和LDH的值，包括B0、R0、D0、W0；每種校準(zhǔn)品測定3次，同一廠家的校準(zhǔn)品于一批內(nèi)完成測定，測定結(jié)果取均值并計(jì)算不同方式復(fù)溶的校準(zhǔn)品與廠家標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品之間的偏倚。

1.2.2方法偏倚評價(jià) 由于B0校準(zhǔn)品是按廠家推薦的標(biāo)準(zhǔn)復(fù)溶方式復(fù)溶，故以B0為校準(zhǔn)品的檢測方法為比對方法；以B-25-2為校準(zhǔn)品的檢測方法為待評方法1，以B-4-0.5-N為校準(zhǔn)品的檢測方法為待評方法2，用上述3種方法測定21份單人血清，每個(gè)重復(fù)測定3次，結(jié)果取均值后使用最小二乘法估算簡單線性回歸的參數(shù)。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)EP9-A3計(jì)算2種待評方法的絕對偏倚、相對偏倚和3個(gè)醫(yī)學(xué)決定水平處的偏倚。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用WPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1不同方式復(fù)溶的校準(zhǔn)品檢測結(jié)果 見表2。德賽、羅氏和和光的校準(zhǔn)品ALP和LDH值在4 ℃和25 ℃下3 h內(nèi)不隨時(shí)間變化。其中貝克曼校準(zhǔn)品B-25-2和B-4-0.5-N的ALP檢測結(jié)果偏倚較大，分別為5%和-4%。對于LDH未發(fā)現(xiàn)明顯偏倚。

表2 不同復(fù)溶方式下校準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品測定值的偏倚(%)

注：“2 h，N”專指未在混勻器上混勻，且放置2 h的貝克曼校準(zhǔn)品。

2.2對血清酶測定結(jié)果的影響 2種貝克曼校準(zhǔn)品校準(zhǔn)后測定21份血清ALP的待評方法斜率分別為0.973 3和1.041 4，截距分別為-1.823 4和1.790 1，R2均為0.999。由于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的絕對偏倚和相對偏倚的分布不是正態(tài)分布，因此計(jì)算偏倚/相對偏倚的中位數(shù)；2種待評方法與比對方法相比，絕對偏倚分別為-4.00 U/L、7.17 U/L；相對偏倚分別為-3.92%、5.06%。由圖1可知，待評方法與比對方法間的相對偏倚較大，部分檢測結(jié)果的相對偏倚已超過來源于生物學(xué)變異的允許偏倚6.4%。2種待評方法測定ALP在3個(gè)醫(yī)學(xué)決定水平處的相對偏倚范圍分別為-5.71%～-3.13%、4.59%～7.12%，見表3。

圖1 2種待評方法與比對方法檢測結(jié)果的相對偏倚分布

表3 2種待評方法在3個(gè)醫(yī)學(xué)決定水平處的偏倚

3 討論

血清中的ALP包括了4種結(jié)構(gòu)基因型：肝臟-骨骼-腎臟型、腸型、胎盤型和生殖細(xì)胞型[2]。不同的ALP最佳反應(yīng)條件也不一樣，2017年的一篇文獻(xiàn)[3]指出人肝/骨型ALP的最佳pH值為10.2，胎盤型ALP的最佳pH值>10.4，其余來源ALP的最佳pH值<10.2。貝克曼校準(zhǔn)品中的ALP來自于牛腸黏膜，羅氏校準(zhǔn)品的ALP來自于基因工程合成的人胎盤型ALP，德賽的ALP來自于人血清，和光的ALP來自于基因工程合成的肝型ALP。這說明不同廠家的試劑需要使用配套校準(zhǔn)品的必要性。貝克曼、德賽、羅氏、和光均聲稱其ALP檢測原理是基于IFCC建議的方法。在pH=10.4條件下，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)作為磷酸酯受體，通過測定磷酸對硝基苯(pNPP)到對硝基苯酚(pNP)的轉(zhuǎn)化率來判斷ALP的活性[4]。德賽、羅氏的ALP試劑1的pH值分別為10.4、10.44。貝克曼和和光的ALP試劑說明書未寫明pH值。

除了必須使用配套的試劑和校準(zhǔn)品以外，校準(zhǔn)品的復(fù)溶方式對檢測也有極大的影響,2014年林素平等[5]主要探討試劑用水量取方式不同對干粉校準(zhǔn)品復(fù)溶后測量系統(tǒng)的影響。本實(shí)驗(yàn)主要探討復(fù)溶方式不同對校準(zhǔn)品復(fù)溶后測定結(jié)果的影響，結(jié)果表明,應(yīng)用相同的試劑和儀器,3種校準(zhǔn)品(B-25-3、B-25-2、B25-4-0.5-N)測定的臨床血清ALP均值比較,平均偏倚高達(dá)5.07%,接近生物學(xué)變異率中推薦的偏倚指標(biāo)6.4%。

在復(fù)溶干粉校準(zhǔn)品時(shí)，酶蛋白結(jié)構(gòu)的完全展開和酶活性的恢復(fù)需要一定的時(shí)間和條件。在其尚未完全展開恢復(fù)活性時(shí)，其實(shí)測值低于校準(zhǔn)品的標(biāo)示值，如果用此校準(zhǔn)品對方法進(jìn)行校準(zhǔn)，那么得到的檢測結(jié)果就會(huì)相對偏高。本實(shí)驗(yàn)中的待評方法2所用校準(zhǔn)品未按照廠家推薦的復(fù)溶方法操作，沒有經(jīng)過30 min的滾筒混勻器且只放置了半小時(shí)就進(jìn)行檢測，所得結(jié)果大幅偏高，其原因可能是因?yàn)槲唇?jīng)完全混勻，導(dǎo)致物質(zhì)在溶液內(nèi)分布不均。而待評方法1中的校準(zhǔn)品是在25 ℃下放置2 h后進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果相對偏低，其原因可能是酶蛋白在溫度相對高的環(huán)境下，展開得更加完全。所以復(fù)溶校準(zhǔn)品時(shí)應(yīng)注意保證與其定值時(shí)的復(fù)溶條件盡量一致。

目前歐洲已強(qiáng)制要求醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的酶學(xué)檢測方法溯源至參考方法。本實(shí)驗(yàn)中的4個(gè)廠家的檢測系統(tǒng)在其說明書上均聲稱其校準(zhǔn)品溯源至IFCC參考方法，但事實(shí)上，由于廠家為了自動(dòng)化分析的需要或生產(chǎn)過程等原因，會(huì)有意無意地對IFCC推薦的參考方法作不同程度的改動(dòng)，因而實(shí)際上各廠家的試劑盒仍存在一定差異[6]。另外各廠家使用的校準(zhǔn)品原料也大不相同。本次實(shí)驗(yàn)中4個(gè)廠家的校準(zhǔn)品均不相同，只有貝克曼的ALP為非人源性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)貝克曼校準(zhǔn)品在針對ALP項(xiàng)目時(shí)不同復(fù)溶方式對檢測結(jié)果有影響。對LDH項(xiàng)目，尚未發(fā)現(xiàn)類似影響；針對其他廠家的校準(zhǔn)品，也未發(fā)現(xiàn)類似影響，這可能與貝克曼校準(zhǔn)品中ALP的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。此外，結(jié)合2012—2016年ALP正確度評價(jià)結(jié)果分析[1]，校準(zhǔn)品復(fù)溶不規(guī)范可能是貝克曼的偏倚通過率偏低的原因之一。

正確復(fù)溶校準(zhǔn)品是實(shí)施準(zhǔn)確檢測的前提。如實(shí)驗(yàn)室工作人員按照不同的方式復(fù)溶校準(zhǔn)品再進(jìn)行檢測，偏倚將會(huì)更大，嚴(yán)重影響臨床醫(yī)生在診斷疾病時(shí)的判斷。所以臨床實(shí)驗(yàn)室的工作人員在使用相關(guān)校準(zhǔn)品時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照校準(zhǔn)品說明書進(jìn)行操作。