邵 康，李衛(wèi)祥，尹伊顏，邢馨洱，那 娜*

(1.國(guó)家癌癥中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院,北京 100021；2.北京師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院,北京 100875；3.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢) 材料化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

抗感冒藥種類繁多，但藥物成分不盡相同，大多以對(duì)乙酰氨基酚、氯苯那敏、右美沙芬、偽麻黃堿、鹽酸金剛烷胺等為主要成分，在解熱鎮(zhèn)痛、抗組胺作用、鎮(zhèn)咳祛痰、收縮血管、抗病毒等方面發(fā)揮著重要作用。此外，還會(huì)添加其他藥物，如咖啡因具有中樞興奮作用，與對(duì)乙酰氨基酚合用，可以用于解熱鎮(zhèn)痛，起到聯(lián)合治療感冒的效果，但服用過多會(huì)產(chǎn)生惡心、肌肉震顫、甚至驚厥等癥狀。然而，市場(chǎng)上的感冒藥，包括西藥、中成藥在內(nèi)，品牌眾多、廠家各異，藥中各成分含量均有一定差異，導(dǎo)致藥效各不相同。在臨床治療中，一旦用藥不當(dāng)，極易引發(fā)不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命安全[1]。因而，需要嚴(yán)格控制和監(jiān)測(cè)藥品中有效成分的含量。目前，常規(guī)檢測(cè)方法主要借助液相色譜分離技術(shù)[2-4]，但該方法的樣品前處理復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，不利于生產(chǎn)過程中大批量藥品的快速質(zhì)量監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)。因而，建立對(duì)藥片中有效成分含量的快速、準(zhǔn)確的分析方法，將為藥物質(zhì)檢部門提供重要參考。

近年來，解吸附電噴霧電離技術(shù)(Desorption electrospray ionization,DESI)的建立開啟了常壓質(zhì)譜技術(shù)的新時(shí)代[5-8]，為無需樣品預(yù)處理，直接、快速獲取分子結(jié)構(gòu)信息提供了有效途徑[9-12]。DESI技術(shù)兼有電噴霧離子化技術(shù)(Electrospray ionization，ESI)和解析電離技術(shù)(Desorption ionization，DI)的特點(diǎn)，通過向樣品直接噴射由ESI產(chǎn)生的帶電霧滴而實(shí)現(xiàn)樣品離子化，并解吸附濺射至質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[13]。該技術(shù)在藥品快速檢測(cè)[14]、爆炸物和化學(xué)戰(zhàn)劑檢測(cè)[15]、食品安全檢測(cè)[16]、生產(chǎn)過程控制和反應(yīng)監(jiān)測(cè)[17]、體內(nèi)代謝及生物成像分析[18-19]等眾多領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用研究[2,20-21]。

本文基于DESI對(duì)藥品直接快速分析的優(yōu)勢(shì)，采用DESI直接對(duì)感冒藥中的對(duì)乙酰氨基酚主要成分進(jìn)行分析。并在驗(yàn)證了該方法對(duì)對(duì)乙酰氨基酚的定性、定量分析可行性的同時(shí)，對(duì)多種不同廠家、不同種類感冒藥進(jìn)行了快速對(duì)比分析，進(jìn)一步展示了其在藥品快速檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

對(duì)乙酰氨基酚(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；甲醇、甲酸(色譜純，上海賽默飛世爾科技有限公司)；淀粉基質(zhì)(分析純，北京化工廠)；實(shí)際樣品：對(duì)乙酰氨基酚片分別購自北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司、吉林省福爾泰藥業(yè)有限公司、吉林吉春制藥股份有限公司。石英毛細(xì)管(河北永年縣銳灃器件有限公司)，檢測(cè)平臺(tái)的樣品載玻片為玻璃載玻片(7.6 cm×2.5 cm，北京化工廠)，高純氮?dú)?北京千禧京城氣體銷售中心)，Pump 11 Pico Plus微量注射泵(Harvard，美國(guó))，HB-Z303-1AC 高壓直流電源(天津淦澤工貿(mào)有限公司)，分析天平(北京賽多利斯儀器公司)，自動(dòng)平臺(tái)運(yùn)行控制系統(tǒng)(北京微納光科自動(dòng)化設(shè)備有限公司)，紅外壓片機(jī)(天津市拓普儀器有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)制備。

圖1 DES-MS裝置的示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DESI裝置的搭建實(shí)驗(yàn)所用的DESI離子源基于文獻(xiàn)進(jìn)行自行搭建，主要分為氣路系統(tǒng)和液路系統(tǒng)兩部分，兩部分通過三通設(shè)計(jì)成內(nèi)、外套管系統(tǒng)[22]。如圖1所示，液路系統(tǒng)為一路由微量注射泵控制流速的溶劑流(3～15 μL/min)，在一定壓力下，通過較細(xì)毛細(xì)管(內(nèi)徑：1.0 mm，外徑：1.3 mm)進(jìn)行輸送。該溶劑為甲醇-水混合溶劑(體積比為1∶1，含0.1%甲酸)，并在液路上加上可控的高壓直流電。為了提供較為穩(wěn)定的高速殼流氣體，氣路系統(tǒng)借助三通，在較細(xì)液流毛細(xì)管外層加裝一個(gè)較粗的毛細(xì)管(內(nèi)徑：250 μm，外徑：365 μm)，讓氮?dú)庖?50 m/s流速通過。在高速氣流作用下，溶劑流在套層毛細(xì)管出口處形成霧滴，并由于高壓電場(chǎng)的作用，霧滴帶上電荷。實(shí)驗(yàn)中，DESI噴口以50°左右的入射角對(duì)著藥片直接噴射，在帶電霧滴的沖擊下，表面上的固體藥片樣品被解吸附同時(shí)離子化，進(jìn)而進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 儀器條件質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)借助Thermo LTQ 型線性離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,San José,CA)開展，由Xcalibur 2.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。在正離子模式下，設(shè)置儀器的最大離子采集時(shí)間為10 ms。實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器參數(shù)如下：質(zhì)荷比m/z范圍為50～300，毛細(xì)管溫度為 250 ℃,毛細(xì)管電壓為 15 V。質(zhì)譜圖是持續(xù)采集信號(hào)得到的平均信號(hào)譜圖，并已扣除背景干擾。為了進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo)信號(hào)峰的存在，進(jìn)行了碰撞誘導(dǎo)解離(Collision-induced dissociation,CID)實(shí)驗(yàn)，二級(jí)質(zhì)譜母離子的選擇窗口(Isolation window)為1.0(m/z)，碰撞能量為20 eV。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備為了模仿藥片基質(zhì)，盡量減少基質(zhì)差異帶來的影響，將淀粉與對(duì)乙酰氨基酚按不同比例混合(總重量為600 mg)，并在瑪瑙研缽中研磨均勻，隨后利用紅外壓片機(jī)制片，壓力為50 kN，保持1 min。借助雙面膠將其固定于測(cè)試平臺(tái)上，利用DESI進(jìn)行測(cè)試。在實(shí)際樣品測(cè)試中，對(duì)購買的藥片直接剝?nèi)ネ鈱犹且?，暴露?nèi)部藥片成分，借助雙面膠將其固定于測(cè)試平臺(tái)上。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜信號(hào)的獲取分析

將標(biāo)準(zhǔn)樣品壓制的淀粉片(0.75 mg/mm2)置于檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行DESI-MS測(cè)試，如圖2A所示，可觀察到很明顯的對(duì)乙酰氨基酚的分子離子峰m/z152。進(jìn)一步借助CID實(shí)驗(yàn)對(duì)該分子離子峰的結(jié)構(gòu)進(jìn)行證明，如圖2B所示，可獲得m/z110的較強(qiáng)碎片信號(hào)，該碎片由母離子m/z152失去乙?；?CH3CO—)而獲得，與文獻(xiàn)報(bào)道的碎裂過程一致[2，23]。因而，利用DESI-MS技術(shù)可以對(duì)藥片中的對(duì)乙酰氨基酚進(jìn)行直接解吸附和離子化檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)可靠的定性分析。

2.2 工作條件的優(yōu)化

為了獲得更好的質(zhì)譜信號(hào)，以對(duì)實(shí)際藥品進(jìn)行定性、定量分析，本實(shí)驗(yàn)以對(duì)乙酰氨基酚純品的檢測(cè)為例，對(duì)毛細(xì)管溫度與高壓電壓進(jìn)行優(yōu)化。如圖3A所示，在50 ℃～300 ℃范圍內(nèi)，隨著毛細(xì)管溫度的升高，對(duì)乙酰氨基酚的分子離子峰m/z152的信號(hào)逐漸增高，并在250 ℃時(shí)達(dá)到最高值，隨后信號(hào)無明顯上升。因而選擇250 ℃為最佳毛細(xì)管溫度。電噴霧的高壓電壓優(yōu)化實(shí)驗(yàn)顯示，在1～5 kV范圍內(nèi)，所獲得的離子信號(hào)隨高壓電壓的增大而逐漸增大，并在5 kV時(shí)達(dá)到最高值，而在6 kV時(shí)信號(hào)增高不明顯(如圖3B所示)。因而，實(shí)驗(yàn)選擇5 kV為最佳電壓。此外，DESI檢測(cè)受基質(zhì)影響較大，在面積相等的淀粉片、二氧化硅片和濾紙表面進(jìn)行DESI檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)乙酰氨基酚樣品的質(zhì)譜總離子流圖差異較大(圖3C)?？紤]到多數(shù)感冒藥片的主要輔料為淀粉，后續(xù)選擇淀粉作為模擬檢測(cè)基質(zhì)。

表1 藥片中加標(biāo)對(duì)乙酰氨基酚的回收率

2.3 定量分析

為了進(jìn)一步對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行初步定量分析，本實(shí)驗(yàn)研究了定量檢測(cè)范圍和檢出限。將不同質(zhì)量的對(duì)乙酰氨基酚純品均勻摻入淀粉基質(zhì)中(總質(zhì)量600 mg)，并用紅外壓片機(jī)壓制成半徑為0.65 cm的樣品片。首先平行制備了3個(gè)對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品的藥片(對(duì)乙酰氨基酚含量為0.75 mg/mm2)，對(duì)DESI-MS檢測(cè)的重復(fù)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示對(duì)乙酰氨基酚分子離子峰的信號(hào)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)為5.7%，表明該方法具有較好的精密度。進(jìn)而，利用DESI直接對(duì)樣品片進(jìn)行逐一測(cè)試。經(jīng)過實(shí)際測(cè)試，獲得DESI取樣點(diǎn)的半徑為150 μm，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符[24]。針對(duì)藥片實(shí)際有效成分的含量信息和實(shí)際檢測(cè)需求，對(duì)對(duì)乙酰氨基酚進(jìn)行線性考察，結(jié)果顯示，在0.35～4.52 mg/mm2的較高濃度范圍得到了較好的定量關(guān)系(I=3 157.34C1.46，r2=0.998 2)，其中I代表質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，C代表藥片表面每平方毫米中對(duì)乙酰氨基酚的含量。檢出限(S/N=3)達(dá)0.237 ng/mm2,定量下限(S/N=10)為1.903 ng/mm2。因而，該方法可以用于藥片中對(duì)乙酰氨基酚有效成分的初步定量分析。進(jìn)一步采用標(biāo)準(zhǔn)加入法研究該方法的準(zhǔn)確性，測(cè)得其回收率為102%～114%(見表1)。

2.4 實(shí)際樣品的分析

選擇了3種市售的來自不同廠家的對(duì)乙酰氨基酚片(主要輔料為淀粉)進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)。在測(cè)試中，首先剝離藥片外層的包裹層，直接裸露內(nèi)部藥品部分，置于DESI噴口前端，讓高速氣流攜帶下的帶電霧滴直接噴至藥品表面，使得藥品被解吸附的同時(shí)離子化，進(jìn)而進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器直接檢測(cè)。如圖4所示，對(duì)實(shí)際藥片的檢測(cè)中，獲得了與對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)樣品較為一致的質(zhì)譜圖以及較高的對(duì)乙酰氨基酚的分子離子峰m/z152?；谒@得離子信號(hào)的強(qiáng)度，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線，可推算出各個(gè)實(shí)際樣品中對(duì)乙酰氨基酚有效成分的含量信息。將所測(cè)得對(duì)乙酰氨基酚含量與商家提供的含量信息相比，該方法檢測(cè)結(jié)果的RSD為7.2%～12%(見表2)，基本符合DESI對(duì)樣品進(jìn)行初步定量分析的要求。

表2 市售對(duì)乙酰氨基酚片的檢測(cè)結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本工作借助DESI-MS對(duì)表面樣品直接解吸附、離子化的優(yōu)勢(shì)，無需樣品預(yù)處理，對(duì)藥品進(jìn)行了直接定性、定量分析?；趯?duì)標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照檢測(cè)，有效獲得了藥品中有效成分的含量信息。需提出的是，該方法在定量分析中，相對(duì)于傳統(tǒng)質(zhì)譜法或色譜法仍存在一定局限性，因而目前該方法主要定位于藥品的簡(jiǎn)單、快速、初篩分析，該工作將為常壓質(zhì)譜技術(shù)在藥物質(zhì)檢及分析領(lǐng)域的快速批量檢測(cè)提供潛在有效手段。