程曉旭,門麗慧,皮子鳳,宋鳳瑞,劉志強

(1.中國科學院長春應用化學研究所 長春質譜中心 吉林省中藥化學與質譜重點實驗室，吉林 長春 130022；2.中國科學技術大學 應用化學與工程學院，安徽 合肥 230026；3.吉林大學 基礎醫(yī)學院，吉林 長春 130021)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是指糖尿病微血管病變導致的腎小球硬化，又稱糖尿病腎小球硬化癥[1-2]，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，極易發(fā)展為終末期腎病[3]。根據(jù)流行病學統(tǒng)計研究，預計到2030年，世界范圍內的糖尿病患者將達到3.66億，而糖尿病腎病患者將超過1億。糖尿病腎病發(fā)病機制復雜，涉及因素眾多。許多研究表明，中藥可以通過多途徑、多靶點治療糖尿病并發(fā)癥，其中，中藥黃芩和梔子對糖尿病腎病的治療作用日漸受到關注。

黃芩(RadixScutellariae)為唇形科植物黃芩(ScutellariabailensisGeorgi)的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等作用[4]。黃酮類化合物為黃芩的主要活性成分，其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素是黃芩的特征性成分。研究表明黃芩及其黃酮類活性成分具有降糖、抗氧化、調節(jié)細胞因子和調節(jié)糖尿病腎病引起的血流動力學改變等作用，可以多途徑、多靶點延緩糖尿病腎病的發(fā)展過程[5-6]。

梔子(Gardeniajasminoides)是茜草科梔子屬植物，中藥梔子是其干燥成熟果實，具有涼血解毒、清熱利尿的功效[7]。研究發(fā)現(xiàn)，梔子的主要成分為環(huán)烯醚萜類化合物，包括梔子苷、山梔苷、京尼平苷等[8]。大量體內外實驗表明梔子具有抗炎、抗氧化、降血壓等生物活性，對糖尿病及其并發(fā)癥的治療效果顯著[9]。

據(jù)歷代本草及醫(yī)學文獻記載，黃芩-梔子藥對為古方常用藥對，配伍應用于許多傳統(tǒng)經(jīng)方。劉舟[10]收集了《中華醫(yī)方精選辭典》和《中藥大辭典》中有關黃芩的論述和方劑,共收集到含黃芩的成方1 067個，涉及中藥272味，除黃連外，梔子與黃芩的配伍頻次位居第二，在228首方劑配伍中出現(xiàn),被廣泛應用于治療肺系病、腎系病、心系病、肝膽系疾病和脾胃系疾病?！吨袊幍洹穂11](2015年版一部)收載了52首含黃芩梔子配伍的方劑，如梔芩清熱合劑、八正合劑、分清五淋丸、龍膽泄肝湯、導赤丸、黃連解毒湯等。黃芩、梔子飲片配伍有其深厚的中醫(yī)藥理論基礎，是中醫(yī)臨床相須炮制配伍的典型范例。

糖尿病腎病早期并沒有明顯的臨床癥狀，但是許多內源性代謝物在臨床癥狀出現(xiàn)以前已經(jīng)發(fā)生了改變。代謝組學可以對內源性代謝物進行全面分析，被廣泛應用于疾病發(fā)生機制的研究[12]。Solini等[13]利用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法和氣相色譜-質譜聯(lián)用法對286例Ⅱ型糖尿病患者的血清樣本和尿液樣本進行了分析，鑒定出5種能夠早期預測腎功能損傷進展情況的代謝物。Hirayama等[14]利用毛細管電泳-質譜聯(lián)用的方法對78例糖尿病患者的血清樣品進行了分析，鑒定出用來區(qū)分糖尿病腎病不同進展階段的19個代謝物。將代謝組學技術應用于糖尿病及其并發(fā)癥的研究中，對糖尿病腎病的早期診斷和早期治療具有重要意義。因此，本文采用代謝組學方法，基于UHPLC-Q-TOF MS技術，對黃芩-梔子藥對對糖尿病腎病大鼠治療前后尿液中的內源性代謝物進行全面地分析鑒定，將藥對治療組與前期工作中黃芩治療組(HQ group)和梔子治療組(ZZ group)的治療效果進行了比較，從整體角度闡述該藥對的配伍科學性及其作用機制。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters ACQUITY UHPLC system，配有BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 m)；Waters Q-TOF SYNAPT G2 HDMS質譜儀，配有4.1版本的MarkerLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和EZinfo 2.0統(tǒng)計軟件。

1.2 試 劑

中藥黃芩、梔子(北京同仁堂長春藥店，由長春中醫(yī)藥大學王淑敏教授鑒定)；鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲酸(色譜純)購自Fisher Scientific公司；去離子水經(jīng)Milli-Q plus制得；血糖儀、血糖試紙購自北京怡成生物電子技術有限公司。

SD 大鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證行SCXK(遼)2015-0001。

2 方法與結果

2.1 動物實驗

正常對照組(Control group，C組)：8只SD雄性大鼠，標準飼料正常喂養(yǎng)。

Ⅱ型糖尿病大鼠造模參照文獻[15]進行，利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)并腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)成功建立糖尿糖大鼠模型。16只糖尿病大鼠隨機分為模型組(Model group，M組)和黃芩-梔子藥對組(HZYD group)，組間血糖差異≤1 mmol/L。

將黃岑-梔子提取物粉末使用超純水溶解，黃岑-梔子藥對組按3 g生藥/kg的劑量每日灌胃給藥1次，模型組和正常對照組分別灌胃與黃岑-梔子藥對組同等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃12周。

2.2 樣品收集與制備

按2∶1的質量比準確稱取中藥黃芩和梔子藥材粗粉，以8倍量60%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液并旋蒸至近干后凍干，得到黃芩-梔子提取物粉末，使用時按給藥量溶解。

收集給藥12周后的大鼠尿液，記錄大鼠24 h排尿量，樣品分裝，-80 ℃冰箱保存待測。使用前4 ℃融化尿液樣品，取1 mL于1.5 mL離心管中，在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾，供UHPLC-Q-TOF MS測定。

2.3 色譜-質譜條件及樣品分析

2.3.1 色譜條件流動相A：0.1%甲酸水,流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～3 min,5%～20% B；3～6 min,20%～40% B；6～8 min,40%～100% B；8～10 min,100% B；10～10.1 min,100%～5% B；10.1～14 min,5% B；流速：0.4 mL/min，柱溫35 ℃，樣品室溫度4 ℃，進樣量5.0 μL。

2.3.2 質譜條件電噴霧離子源正負離子檢測模式，電離源溫度為120 ℃，去溶劑氣溫度為350 ℃，錐孔氣和去溶劑氣均為氮氣，流速分別為50 L/h和700 L/h。正離子模式下毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為30 V，提取錐孔電壓為5.0 V；負離子模式下毛細管電壓為2.5 kV，錐孔電壓為30 V，提取錐孔電壓為5.0 V。掃描范圍為100～1 000m/z，掃描時間為0.2 s。以甲酸鈉建立質量軸標準曲線，亮氨酸腦啡肽(Leucine-enkephalin，LE)進行實時質量校正以確保質量精度和重現(xiàn)性。

為得到相對全面和整體的代謝物輪廓，保證分析系統(tǒng)的可靠性及穩(wěn)定性，在整個分析過程中，重復運行質控樣品(Quality control，QC)來衡量UPLC-MS分析方法的穩(wěn)定性。從正常樣品中各取30 μL混合，制得QC樣品，在用于方法驗證時，為避免誤差，QC樣品將被隨機測試。樣品分析前，先運行6次QC樣品以平衡系統(tǒng)，樣品檢測過程中，每檢測10個正常樣品后運行1次 QC 樣品以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用MassLynx V 4.1(Waters)軟件對MassLynx V4.1 UHPLC-MS的原始數(shù)據(jù)進行峰檢測，MarkerLynx Application Manager(Waters)將自動進行離子對提取、峰對齊、峰匹配和峰強度校正,得到的數(shù)據(jù)矩陣通過Umetrics Ezinfo 2.0(Waters Corporation，Milford，USA)進行多變量分析。利用生物學數(shù)據(jù)庫，如HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、Massbank(http://www.massbank.jp/)和KEGG(https://www.kegg.jp/)等進行生物標記物的鑒定和代謝通路的分析。

2.5 生物標記物的鑒定

采用基于UHPLC-Q-TOP MS的代謝組學方法分析C組大鼠和M組大鼠尿液中內源性代謝物的變化，結合主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)進行數(shù)據(jù)分析，篩選潛在生物標記物。由PCA得分圖(圖1)可知，正離子和負離子模式下M組與C組大鼠的尿液代謝輪廓區(qū)分明顯，DN大鼠尿液代謝出現(xiàn)明顯的擾動。S-plot圖(圖2)中每一個點都代表一個化合物，距離原點越遠的點，其代表的化合物對分組的影響越大，VIP值越高。選擇VIP值大于1且獨立T檢驗的p值小于0.05 的化合物為潛在生物標記物,根據(jù)它們的精確分子量和串聯(lián)質譜結果與 Human Metabolome Database(HMDB)和 Mass Bank等質譜數(shù)據(jù)庫質譜信息的匹配，對可能的潛在標記物進行鑒定。綜合以上信息，共鑒定出與糖尿病腎病相關的潛在生物標記物31個，對比黃岑-梔子藥對組與模型組中各標記物的含量，得到藥對回調的生物標記物16個，結果列于表1及表2。

圖2 M組和C組大鼠12周尿液樣品經(jīng)OPLS-DA分析獲得的S-plot圖

表1 正離子模式下DN大鼠尿液生物標記物和變化趨勢

(續(xù)表1)

PotentialbiomarkersRt(min)Measuredmass(Da)Error(ppm)MolecularChangetrendM/CHZYD/MHQ/M[16]ZZ/M[17]3-Indolecarboxylicacidglucuronide(3-吲哚羧酸葡糖苷酸)1.89338.08681.0C15H15NO8↑×↓×Glucose(葡萄糖)1.21181.06918.6C6H12O6↑×↓×4,6-Dihydroxyquinoline(4,6-二羥基喹啉)3.62162.05659.5C9H7NO2↓×↑×Histidinal(組氨醛)0.68140.08068.8C6H9N3O↑×↓×Imidazoleaceticacid(咪唑乙酸)0.61127.04937.1C5H6N2O2↑×↓×Phenylaceticacid(苯乙酸)2.60137.05813.6C8H8O2↑×↓×Ornithine(鳥氨酸)4.81133.09967.9C5H12N2O2↑×↓×Leucine(亮氨酸)2.30132.10097.6C6H13NO2↑×↓×Pantetheine(泛酰硫氫乙胺)2.47279.13812.9C11H22N2O4S↑×↓×Xanthosine(黃嘌呤核苷)3.12285.08102.7C10H12N4O6↑×↓×5-Hydroxykynurenamine(5-羥基犬尿胺二鹽酸鹽)2.97181.09596.9C9H12N2O2↓×-×Phenylacetaldehyde(苯乙醛)3.00121.06689.2C8H8O↑×-×Hydrocinnamicacid(氫化肉桂酸)7.57151.07533.6C9H10O2↑--×L-Cysteine(L-半胱氨酸)3.20122.02808.0C3H7NO2S↓×-×Kynurenicacid(犬尿喹啉酸)2.17190.05000.7C10H7NO3↑××↓Creatinine(肌酐)0.86114.06652.7C4H7N3O↑××↓6-Hydroxy-5-methoxyindoleglucuronide(6-羥基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸)2.38340.10377.1C15H17NO8↑××-6-Methoxy-pyridine-3-carboxylicacid(6-甲氧基-吡啶-3-羧酸)0.61154.05075.4C7H7NO3↓××↑3-Methoxybenzenepropanoicacid(3-甲氧基苯丙酸)3.52181.08674.3C10H12O3↓××↑Indole-5,6-quinone(吲哚-5,6-苯醌)2.27148.04006.7C8H5NO2↓××↑Thymine(胸腺嘧啶)1.02127.05063.1C5H6N2O2↓××-Homocysteinethiolactone(同型半胱氨酸硫代內酯)5.46118.03318.4C4H7NOS↓××↑

M/C：metabolite change trend in M group compared with C group;HZYD/M：metabolite change trend in HZYD group compared with M group;HQ/M：metabolite change trend in HQ group compared with M group;ZZ/M：metabolite change trend in ZZ group compared with M group;the up “↑” and down “↓”arrows represent the relative increasing or decreasing trend of the metabolites,“-”represents no significant differences between the two groups,“×”denotes the metabolite were not identified as potential biomarkers(M/C：模型組vs空白組；HZYD/M：黃芩-梔子藥對組vs模型組；HQ/M:黃芩組vs模型組；ZZ/M：梔子組vs模型組；“↑”表示含量上升，“↓”表示含量下降，“-”表示兩組相比較時，該化合物含量沒有顯著性差異；“×”表示該化合物未被鑒定為潛在生物標記物)

表2 負離子模式下DN大鼠尿液生物標記物和變化趨勢

(續(xù)表2)

PotentialbiomarkersRt(min)Measuredmass(Da)Error(ppm)MolecularChangetrend?M/CHZYD/MHQ/M[16]ZZ/M[17]Phenylacetylglutamine(苯乙酰谷氨酰胺)3.54263.10264.3C13H16N2O4↑×↓×Phenylpyruvicacid(苯丙酮酸)1.82163.04215.7C9H8O3↑×↓×3,4-Dihydroxymandelaldehyde(3,4-二羥基甘露醛)1.20167.03743.7C8H8O4↑×↓×Cholicacid(膽酸)9.01407.27991.7C24H40O5↑××↓3-Oxooctanoicacid(3-酮基辛酸)4.69157.08672.0C8H14O3↓××↑

*the same as those in table 1

2.6 生物標記物代謝通路分析

為闡明這些潛在生物標記物與糖尿病腎病的關系以及潛在生物標記物之間的相互聯(lián)系，在KEGG中檢索已獲得的潛在生物標記物，將得到的信息聯(lián)系起來，建立了黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病代謝網(wǎng)絡圖，結果見圖3。

圖3 黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病代謝網(wǎng)絡圖

由代謝網(wǎng)絡圖可知，黃芩-梔子藥對可能會通過調節(jié)糖尿病腎病引起的膽汁酸合成、能量代謝、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、色氨酸代謝等代謝通路的異常來阻斷病情的發(fā)展，發(fā)揮治療作用。

2.6.1 膽汁酸的生物合成通路膽汁酸是哺乳動物膽汁中發(fā)現(xiàn)的類固醇酸，是衍生自膽固醇分解代謝的兩親性甾體分子。脫氧膽酸是膽汁酸合成通路的重要組成部分，12-酮基去氧膽酸、3-氧代-4,6-膽甾烯酸和7-酮基脫氧膽酸是膽汁酸類內源性代謝物。作為一種重要的內分泌信號因子，膽汁酸可以對脂質、葡萄糖和能量代謝穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不同影響，與肥胖和糖尿病的發(fā)病相關[18]。研究表明，正常體重以及超重Ⅱ型糖尿病患者的血糖與尿液膽汁酸排泄量呈正相關，機體通過膽汁酸信號傳導的代償性增加來維持體內葡萄糖平衡[19]。本研究中糖尿病腎病大鼠尿液中膽汁酸的含量急劇上升，與上述研究結果一致。黃芩-梔子藥對可以降低膽汁酸合成通路中脫氧膽酸的含量(表1)，調節(jié)上升的膽汁酸，顯著降低12-酮基去氧膽酸、3-氧代-4,6-膽甾烯酸、脫氧膽酸和7-酮基脫氧膽酸的含量，提示黃芩-梔子藥對可能通過減少膽汁酸的合成和調節(jié)膽汁酸代謝改善糖尿病腎病病程發(fā)展。本課題組前期分別考察了梔子、黃芩單味藥對糖尿病腎病大鼠尿液中內源性代謝物的影響[16-17]，綜合表1和表2結果可知，黃芩對膽汁酸的合成與代謝并無影響，黃芩-梔子藥對對膽汁酸的調節(jié)作用可能主要來自于梔子。

2.6.2 能量代謝通路三羧酸循環(huán)是機體的主要供能途徑，琥珀酸和檸檬酸是其重要組成部分，二者的含量變化反應了供能狀況的變化。三羧酸循環(huán)代謝向氧化磷酸戊糖途徑的通量相對增加，會導致琥珀酸產(chǎn)生增加，減少通路中副產(chǎn)物的形成，破壞氧化還原平衡[20-21]。琥珀酸和檸檬酸不僅與能量代謝相關，還是腎臟損傷的標記物。本研究中，模型組大鼠尿液中琥珀酸含量升高，檸檬酸含量降低，可能是三羧酸循環(huán)和腎臟功能損傷共同作用的結果。梔子有加重檸檬酸含量下降的作用，黃芩有回調檸檬酸含量的作用，配伍之后，綜合二者藥效，黃芩-梔子藥對仍起到了回調檸檬酸含量的作用。此外，由表2可以看出，黃芩和梔子單味藥并未對琥珀酸含量的升高有任何調節(jié)作用，但黃芩-梔子藥對卻對琥珀酸起到了回調作用，這說明黃芩與梔子之間，黃芩、梔子與藥對之間的作用都不盡相同，黃芩和梔子的配伍使藥對發(fā)揮了單味藥沒有的功效。

2.6.3 苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸代謝通路慢性腎衰竭與苯丙氨酸和酪氨酸的合成、代謝以及尿液排泄量的變化密切相關[22-23]。苯丙氨酸是酪氨酸的前體化合物，腎臟功能受到損害時，苯丙氨酸向酪氨酸轉化受阻，受阻程度與腎臟受損程度相關。苯丙氨酸是一種必需氨基酸，主要代謝途徑為羥基化生成酪氨酸。苯丙氨酸還可以轉化為苯丙酮酸，苯丙酮酸還原后生成苯基乳酸，或氧化脫羧生成苯乙酸，但這種途徑作用較弱[24]。綜合表1和表2可知，糖尿病大鼠尿液中苯丙酮酸、苯乳酸、苯乙酸和苯乙酰谷氨酰胺含量均升高，可能意味著苯丙氨酸向酪氨酸轉化受阻，從而導致苯丙氨酸更多的向苯丙酮酸代謝途徑代謝。黃芩可以下調苯丙酮酸、苯乳酸和苯乙酸的含量，但梔子和藥對均無下調作用，說明對苯丙氨酸代謝通路的調節(jié)作用主要來自于黃芩。

腎臟是消除色氨酸及其代謝物的主要器官。95%左右的色氨酸在腎臟經(jīng)犬尿氨酸途徑代謝，最終產(chǎn)生犬尿喹啉酸等代謝物[25-26]。犬尿喹啉酸與腎小球濾過率呈負相關，色氨酸代謝異常與Ⅱ型糖尿病的發(fā)病息息相關[27]。與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠尿液中犬尿喹啉酸含量升高，表明腎臟功能受到損害。梔子可以降低犬尿喹啉酸的含量，對腎臟起到一定的保護作用。黃芩和藥對都未對犬尿喹啉酸起到調節(jié)作用，可能是藥對配伍后，來自梔子的部分藥效降低了。

2.6.4 尿毒素代謝通路除圖3所示的各種代謝通路外，尿毒素代謝也是黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病的重要代謝通路。硫酸對甲酚是對甲苯酚通過尿液排泄的衍生物，是一種典型的尿毒素。腸道厭氧菌將食物中的苯丙氨酸和酪氨酸轉變?yōu)?-羥基苯乙酸，脫羧后轉變?yōu)閷追樱瑢追釉谀c道上皮細胞的作用下轉變?yōu)榱蛩釋追覽28]。硫酸對甲酚是腎病中常見的蛋白結合分子，作為一種尿毒素，具有高蛋白結合率、低排泄率和促氧化應激作用，較難通過透析排出體外[29]。硫酸對甲酚的排泄量與腎小球濾過功能密切相關，糖尿病腎病導致腎臟功能受損時，體內硫酸對甲酚含量升高[30]，促使炎癥發(fā)生，硫酸對甲酚在血液中與白蛋白的結合增多，可以加速腎病發(fā)展，對全身多個組織和器官造成毒性損害，是腎臟疾病惡化的重要指示代謝物。糖尿病腎病大鼠尿液中的硫酸對甲酚含量明顯升高，經(jīng)黃芩、梔子單味藥治療后，含量并未發(fā)生變化，但經(jīng)黃芩-梔子藥對治療干預后，其含量顯著降低,說明黃芩-梔子藥對可能通過對腸道菌群的調節(jié)，減少硫酸對甲酚的產(chǎn)生，或通過增強腎小球濾過功能使硫酸對甲酚排泄量增多?？珊侠硗茰y經(jīng)黃芩-梔子藥對治療后，受損的腎臟功能得到了改善。

3 結 論

本研究采用 UPLC-Q-TOF MS 結合 OPLS-DA 的分析手段，進行了黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病大鼠的尿液代謝組學研究，對糖尿病腎病大鼠尿液中的內源性代謝物和代謝通路進行了全面地分析。黃芩-梔子藥對可以回調16種糖尿病腎病相關的生物標記物，主要通過調節(jié)膽汁酸的合成與代謝、能量代謝和尿毒素代謝改善糖尿病腎病引起的尿液代謝輪廓變化。從黃芩-梔子藥對整體作用角度初步闡明了其治療糖尿病腎病的作用機理，證明了黃芩-梔子藥對配伍后，可以產(chǎn)生單味藥沒有的藥效。