代榮榮，馬 鑫，邵心陽，柴胡玲瀟，王冠博*

(1.南京師范大學 化學與材料科學學院，江蘇 南京 210023；2.北京諾和諾德醫(yī)藥科技有限公司，北京 102206；3.北京大學 前沿交叉學科研究院，北京 100871；4.深圳灣實驗室 細胞分析研究所，廣東 深圳 518055)

單克隆抗體(mAb)藥物由于其結合特異性、靶點多樣性、設計定向性等特點，近年來在研發(fā)投入、審批數(shù)量和市場規(guī)模等方面發(fā)展迅速[1]。mAb作為一類蛋白質，不僅具有分子量大、結構層次復雜的特點，還在翻譯后修飾(PTMs)等因素的作用下，呈現(xiàn)一定程度的固有結構微異質性[2-5]。在多種PTM中，糖基化不僅是微異質性的重要貢獻者，更對mAbs的構象、半衰期、功效和安全性等方面產生重要影響[6-8]。對mAb進行分子量測定并鑒定共存的糖型，對mAb的設計、生產和臨床使用均至關重要。

質譜(MS)技術當前已被廣泛用于mAb的分子量及糖型分析。在酶解所得的游離糖基鏈層面、糖肽層面和完整mAb層面進行糖型分析各具優(yōu)缺點[9-13]，其中在完整mAb層面進行糖型分布剖繪引入的樣品前處理最少，操作最為便捷，理論上具有更高的測定通量。此外，由于無需對碎片信息進行拼合，該方式獲得的分子量信息更加直接，所得糖型分布更能反映藥物分子層面的實際情況，在無需分析糖基鏈結構的情況下，堪為首選策略。既有研究表明，利用納升電噴霧(Nanospray)離子化方式和超高分辨質譜儀器，在低流速下測定完整mAb可獲得較理想的分子量和糖型數(shù)據[14-15]。然而，由于對完整糖蛋白的測定涉及高分辨儀器及相對復雜的參數(shù)設置，分子量及糖型測定結果可因多種儀器設置、操作參數(shù)及溶液條件的影響而產生假陽性或假陰性結果。為保證測定結果的準確性，需對相關條件的影響進行深入研究，并在測定中對實驗條件進行細致優(yōu)化。

本文以經過完善質量控制的mAb為標準樣品，以具有完整大型蛋白分子測定能力的超高分辨質譜為工具，考察了低流速進樣模式下，儀器分辨率、源內裂解、碰撞誘導碎裂、溶液組成等條件對分子量及糖型測定結果的影響，以期獲得優(yōu)化的完整mAb分子測定方案，助力于mAb的表征和相關研究。

1 實驗部分

1.1 材料試劑

單克隆抗體(mAb)樣品由北京諾和諾德醫(yī)藥科技有限公司提供；乙酸銨(NH4Ac)、甲酸、甲醇均為色譜純，購自美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 儀器設備

Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap質譜儀，配商品化靜態(tài)納升電噴霧離子源(德國Thermo Fisher Scientific)；NanoDrop 2000紫外可見吸光光度儀(美國Thermo Fisher Scientific)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理取適量mAb原液置于分子量截斷值為50 kDa的超濾管(美國Milipore)中，在4 ℃下離心超濾，補入150 mmol/L NH4Ac溶液進行鹽溶液置換，得樣品濃溶液。非變性樣品、變性樣品分別以150 mmol/L NH4Ac水溶液、含體積分數(shù)75%甲醇及0.5%甲酸的水溶液稀釋至2 μmol/L。溶液濃度測定利用波長為280 nm的紫外光吸收實現(xiàn)。

1.3.2 質譜分析取2～2.5 μL樣品溶液注入靜態(tài)噴針(德國Thermo Fisher Scientific)進行納升電噴霧離子化進樣。除正文提及的變量參數(shù)外，主要參數(shù)如下：microscan：5，maximum injection time：100 ms，desolvation voltage：-10 V。如無特殊說明，折合m/z400處的分辨率均設為50 000。二級質譜(MS2)分析中母離子選擇寬度為100 Th。數(shù)據圖中每個質譜圖均為80幀原始譜圖積累所得。數(shù)據采集過程中保持噴霧電壓和噴針位置不變，避免其對分析物價態(tài)分布的影響。

1.3.3 數(shù)據處理去卷積化分析利用BioPharma Finder 3.1(Thermo Fisher公司)軟件進行，采用isotopic profile模式輸出分子量分布；糖型鑒定采用既往工作[16]中所述方法。

2 結果與討論

2.1 源內碎裂的影響

源內碎裂(In-source fragmentation)可通過樣品離子與空氣分子的碰撞改善去溶劑化性能，減少加合物，提高分子量測定的準確度。如源內碎裂不充分，可能產生較多加合物信號及非特異性寡聚體信號[17]；而源內碎裂過強，則可能導致樣品分子自身發(fā)生共價鍵斷裂。在對mAb的測定中，關閉源內碎裂所得譜圖中除mAb單體外，可見少量非特異性結合的二聚體及三聚體存在；開啟源內碎裂，則隨著能量加強，非特異性寡聚體豐度減少甚至消失(圖1A)，mAb單體的平均價態(tài)略有升高，各價態(tài)對應的m/z分布呈現(xiàn)如圖1B所示的變化：未開啟源內碎裂時m/z分布較寬，可見較多未完全分離的信號峰；隨著碎裂電壓升至150 V，m/z分布趨于簡化，3個主要信號峰中相鄰2個所對應的分子量差異均為162 Da，為六碳糖殘基對應的分子量。依據mAb糖基鏈的結構特點，此圖說明相應3個糖型中相鄰2個相差1個半乳糖殘基。依據信號的相對強度關系，可定量解析相應糖型的相對豐度關系。在此3個信號峰右側相差35～38 Da處可見加合物信號峰，且隨碎裂能量增大而逐漸減弱；開啟源內碎裂且碎裂電壓升至150 V前，低豐度信號峰圖無明顯變化，表明在此條件區(qū)間內鑒定低豐度糖型較為可靠。碎裂電壓升至200 V后，主要信號峰有明顯展寬，對應的平均分子量均減小，表明發(fā)生了較大程度的中性丟失，分子量測定值已不可靠；在低m/z區(qū)可見大量碎片離子峰，同樣表明在極端的源內碎裂條件下mAb自身發(fā)生碎裂。

2.2 儀器分辨能力的影響

儀器分辨能力及分辨率設定值直接影響譜圖的分辨率以及分子量接近的糖型是否能被明確區(qū)分?？衫每赡艽嬖诘臍埢g的分子量數(shù)值，通過計算獲得區(qū)分不同糖型所需的最低分辨率。如表1所示，己糖及脫氧己糖分子量之差為16 Da；若2個mAb分子之間1條糖基鏈等同而另1條糖基鏈分別為G2及G1F，則在完整mAb層面至少需要約9 400的譜圖分辨率方能區(qū)分兩種分子。由于儀器操作界面中可調節(jié)的分辨率數(shù)值僅為針對低m/z的等效參考值，因此需根據儀器在高m/z區(qū)域的實際分辨性能調節(jié)分辨率設定值。

表1 幾種代表性單糖殘基的分子量差異

*relative to theMWof an intact mAb(approximately 150 kDa)

圖2 +22價mAb離子在不同標稱分辨率(m/z 400等效)下的非變性質譜信號分辨情況

針對此mAb樣品，考察了m/z400處等效標稱分辨率設定值為3 125～50 000范圍的信號分辨情況(源內碎裂電壓調至150 V，圖2)。結果顯示，僅當標稱分辨率達到50 000時，主要糖型峰及其鄰近的加合物峰(分子量差值測定值為35～38 Da)可被分辨；標稱分辨率為12 500時，大量低豐度糖型難以檢測；標稱分辨率降至3 125時，高豐度糖型也無法區(qū)分，譜圖中僅能通過峰值處對應的m/z計算最高豐度糖型對應的平均分子量。

圖3 +23價mAb離子在不同碰撞能量下的m/z圖(HCD模式)

圖4 變性條件對完整mAb譜圖的影響

2.3 碰撞誘導碎裂的影響

在質譜質量分析器內部發(fā)生的碰撞誘導碎裂(CID)可起到進一步去除加合物的作用，但因其多為多級質譜分析所采用，碰撞能量可調上限較高，在可調節(jié)區(qū)間內更容易造成分析物自身的碎裂。由于唾液酸等單糖殘基容易在碰撞中丟失，碰撞也會造成糖型鑒定失真。本實驗所用儀器通過高能碰撞解離(HCD)實現(xiàn)碰撞。如圖3所示，當使用N2作為碰撞氣時，5%的碰撞能量有效消除了加合物而未引起其它明顯變化，虛線框中所示的低豐度糖型信號未受影響；10%的碰撞能量造成了明顯的中性丟失，使主要糖型信號峰對應的平均分子量減少70 Da左右，同時由于基線升高，使得低豐度糖型信號被掩蓋。如使用Xe作為碰撞氣，5%左右的碰撞即造成了更大程度的中性丟失，使得最高豐度分子量減小300 Da以上。

2.4 溶液條件的影響

對完整mAb的測定在多種情況下需使用含有機溶劑或酸的變性條件，如與液相分離手段的在線/離線聯(lián)用[18]、對mAb的穩(wěn)定性研究[19]等。盡管在常規(guī)ESI等高流速條件下有機溶劑或酸的存在可一定程度上提高信號響應，但由于二者可顯著改變溶液黏度等流體性質，在低流速下進樣時，需對最適條件進行更加細致的優(yōu)化。本研究使用含體積分數(shù)75%甲醇和0.5%甲酸的水溶液配制變性條件樣品溶液，采用源內碎裂150 V、標稱分辨率50 000、HCD模式關閉的條件采集數(shù)據，結果如圖4所示。此條件下mAb的價態(tài)呈現(xiàn)二重分布，高價態(tài)分布中豐度最高的價態(tài)為+36，表明mAb發(fā)生了顯著的去折疊；低豐度分布的平均價態(tài)及分布寬度較非變性譜圖也明顯增加(圖4A)。分別取低、高價態(tài)分布中的單一價態(tài)圖樣(圖4B及圖4C)觀察，仍可見主要糖型的信號峰，但由于基線顯著升高且出現(xiàn)了大量加合物信號峰，主要糖型的信號分辨率及相對強度都受到很大影響。

圖5 多種條件下完整mAb質譜數(shù)據的去卷積化結果比較

2.5 去卷積化結果所受的影響

將上述條件下所得的質譜數(shù)據進行去卷積化處理，可得完整蛋白分子量分布圖(圖5)。在非變性條件(Native condition)的測定中，理想條件下(Optimal)，主要糖型對應的峰(圖5中豎直實線所示)得到明顯分離，可利用各自的峰面積進行糖型分布的相對定量，低豐度糖型對應的峰清晰且可分辨；在低源內碎裂等情況下的去溶劑化不良條件下(Suboptimal desolvation)，可見主要糖型對應的峰，但由于大量其它相鄰信號峰的存在，分辨率及定量準確度都會受到很大影響。這些其它信號峰中既包含溶劑及鹽離子參與形成的加合物峰[20]，也可能包含真實存在且在氣相中易碎的糖型所對應的信號峰。圖5中點劃線及等距虛線所示的3組信號峰均與左側相鄰的主要糖型信號峰對應分子量相差較為固定的數(shù)值((61±1)Da及(127±4) Da)，可能由含有唾液酸等易掉落殘基的糖型所產生。即使這些信號峰確由相關糖型引起，對其進行保留的意義依然有限，原因包括：(1) 相關糖型對氣相碰撞條件極為敏感，碎裂程度難以精確控制；(2) 相應信號易與加合物信號及其它穩(wěn)定糖型信號重疊，影響譜圖分辨效果，進而影響糖型鑒定和定量；(3) 唾液酸殘基與己糖殘基的分子量差值(129 Da)與C-端賴氨酸剪切(在mAb骨架上經常發(fā)生)所造成的分子量差值(128 Da)相近，極易造成對蛋白型的錯誤歸屬。因此，適當增強碎裂效果，使唾液酸殘基掉落，保持剩余糖型在較寬條件范圍內分布穩(wěn)定，可能為糖型鑒定帶來更大收益。如需測定含唾液酸糖型的含量，可由衍生化等方式進行處理，提高相應糖型的穩(wěn)定性后實現(xiàn)[21]。在源內碎裂程度極高或發(fā)生程度較高的CID等情況下，mAb分子因發(fā)生自身碎裂并丟失電中性碎片(Neutral loss)，質譜圖發(fā)生扭曲，且低豐度糖型信號被掩蓋，同樣會增加大量的假陽性糖型鑒定結果。在非變性條件下(Denaturing condition)，若無法在數(shù)據采集階段達到最佳的去溶劑化效果，無論通過高價態(tài)分布還是低價態(tài)分布信號進行去卷積，所得結果均為基線較高、結合物種類較多且豐度較高、分辨率較低的質量分布，難以進行準確的糖型鑒定。這也表明在通過液相色譜-質譜聯(lián)用或毛細管電泳-質譜聯(lián)用等方式測定完整mAb分子量時，需在參數(shù)優(yōu)化上付出更多的努力，以減小去溶劑化不良帶來的影響。

3 結 論

使用質譜手段對完整mAb藥物分子量測定和糖型鑒定時，在低流速下進樣(如使用納升電噴霧離子化)可節(jié)約樣品并獲得較高的離子化效率。非變性質譜測定可在較寬的條件范圍內獲得穩(wěn)定的分析結果；而在常規(guī)電噴霧離子化進樣中對信號響應有提升作用的變性條件(含有機溶劑或酸)反而易對數(shù)據質量產生不利影響，需針對去溶劑化性能進行細致的條件優(yōu)化以減少加合物的干擾。在變性條件下測定時，為確保分子量及糖型分析結果的準確性，理想情況下需與非變性條件下所得結果或其它分析方法所得結果相比較，進行方法驗證；在非變性條件下，源內碎裂程度、儀器分辨率、CID、溶劑條件等均會對測定結果產生顯著影響，需根據這些參數(shù)的影響程度、條件控制難易及相應的結果收益進行綜合評價，選擇合適的參數(shù)。根據本項工作的實驗結果，為保證測定數(shù)據穩(wěn)定可靠，建議使用中等強度的源內碎裂參數(shù)，提升去溶劑化效果，減少溶劑/鹽加合物的形成，并避免發(fā)生mAb分子的共價鍵斷裂；建議使用具有高分辨能力的質譜儀器，并調節(jié)設置使實際信號的譜圖分辨率達到4 000以上(實際分辨率受去溶劑化等條件的影響，難以通過低m/z區(qū)的標稱分辨率進行直接換算)，以確保分子量相近的糖型得以分辨；若儀器具有CID功能，建議不開啟CID或僅在需要增強去溶劑化效果的情況下啟用最低能量的CID，避免mAb的碎裂。

致謝：本工作受到國家自然科學基金青年項目(21605085)及中國科協(xié)青年人才托舉工程項目(2017QNRC001)的資助。感謝北京諾和諾德醫(yī)藥科技有限公司提供樣品和抗體技術支持；感謝與該單位楊志茹博士及吳曉愛博士進行的有益討論。