劉亞琪，王中華*，何秉淑，謝 冰，霍美玲，傅文清，周 幟，再帕爾·阿不力孜，2

(1.中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，生物成像與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100081；2.中央民族大學(xué) 藥學(xué)院，北京 100081)

腎臟是人體重要的代謝和排泄器官，腎功能異常與多種疾病密切相關(guān)。目前，臨床診斷腎臟疾病和藥物腎毒性的常用指標(biāo)為尿素氮(BUN)、血清肌酐(CR)和尿酸(Ua)，但這些指標(biāo)易受性別、年齡、體重等因素的影響[1]，因此需要尋找特異性更強(qiáng)、靈敏度更高的生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)源性小分子代謝物的整體及其變化規(guī)律的科學(xué)，是發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的重要手段。目前，代謝組學(xué)在腎臟疾病診斷和藥物腎毒性研究中已獲得廣泛應(yīng)用。但已有研究多采用血液、尿液作為分析樣本，腎臟組織代謝組學(xué)研究仍較少，而開(kāi)展腎臟組織代謝組學(xué)研究有助于獲得具有組織特異性的生物標(biāo)志物。

腎臟組織中的代謝物具有種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣、極性差異大等特點(diǎn)，對(duì)腎臟代謝組的全面分析提出了很大挑戰(zhàn)。目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)[2-6]因具有高靈敏度、高通量、強(qiáng)特異性的特點(diǎn)，已成為代謝組學(xué)研究中最常用的分析手段。代謝組學(xué)研究中提取組織樣本的溶劑體系主要有甲醇/水、乙腈/水、甲醇/氯仿/水、甲醇/二氯甲烷/水[7-9]。但甲醇/水、乙腈/水只能提取強(qiáng)極性部分，獲得的代謝物信息不夠完整；甲醇/氯仿/水體系中，氯仿具有一定的毒性和環(huán)境污染性。另外，甲醇/二氯甲烷/水在提取時(shí)，強(qiáng)極性部分與弱極性部分上下層分離后，固體沉積物處于中間層，易造成對(duì)下層提取物的污染。此外，目前腎臟組織的代謝組學(xué)分析方法多采用單一的C18色譜柱進(jìn)行色譜分離和分析，易造成強(qiáng)極性代謝物信息的缺失。因此，亟需建立一種對(duì)腎臟組織中小分子代謝物進(jìn)行全面分析的代謝組學(xué)分析方法。

本研究以高靈敏、高分辨的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)為分析手段，采用甲基叔丁基醚/甲醇/水溶劑體系對(duì)大鼠腎臟組織中的代謝物進(jìn)行提取，采用HILIC親水色譜柱和反相C18色譜柱相結(jié)合的色譜分離系統(tǒng)對(duì)代謝物進(jìn)行分離，并以10種代表性代謝物為研究對(duì)象，優(yōu)化建立了適用于大鼠腎臟組織中小分子代謝物全面分析的代謝組學(xué)分析方法。該方法可同時(shí)獲取腎臟組織中強(qiáng)極性和弱極性代謝物信息，具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，適用于腎臟疾病和藥物腎毒性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜(Ultramate 3000)、Q-OT-qIT雜合型質(zhì)譜儀(Orbitrap Fusion Lumos)、移液器(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；冷凍干燥機(jī)與真空離心濃縮儀(德國(guó)Christ公司)；離心機(jī)、混勻儀、渦旋儀(德國(guó)Eppendorf公司)；高速分散機(jī)(德國(guó)IKA公司)；0.22 μm濾膜(美國(guó)Agilent公司)。

牛磺酸(Taurine)、肌酸(Creatine)、L-異亮氨酸(L-Isoleucine)、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤(1-Methylguanine)、5-甲硫腺苷(5-Methylthioadenosine)；溶血磷脂酰膽堿：LysoPC(14∶0)、LysoPC(16∶0)、LysoPC(17∶0)、LysoPC(18∶0)、LysoPC(18∶2)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。乙腈、甲醇(德國(guó)Merck公司)；甲酸(美國(guó)ROE公司)；甲基叔丁基醚(MTBE，美國(guó)J.T.Baker公司)；乙酸銨(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；二氯甲烷(美國(guó)Mreda公司)。所有試劑均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為某品牌純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與制備取SD大鼠腎臟，用生理鹽水清洗表面血跡后立即置于液氮中冷凍保存，使用研缽在液氮中研磨成粉，粉末置于冷凍干燥機(jī)48 h。取凍干后的腎臟組織10 mg置于離心管中，加入400 μL預(yù)凍的冷溶劑(75%甲醇水)，用高速分散機(jī)勻漿3 min(25 000 r/min，1 min；3 000 r/min，1 min；25 000 r/min，1 min)。超聲10 min后加入1 mL甲基叔丁基醚，渦旋提取10 min(2 000 r/min)后，將樣品置于4 ℃冰箱20 min，于4 ℃離心15 min(15 000 r/min)，將上清液與蛋白和細(xì)胞沉淀物分離。上清液分為兩層：甲基叔丁基醚/甲醇層(上層：弱極性代謝物)和甲醇/水層(下層：強(qiáng)極性代謝物)，分別置于真空濃縮儀中濃縮至干，干燥時(shí)間分別約為2 h和1.5 h。取甲醇/水層干燥物用乙腈/水(80∶20，體積比)復(fù)溶至200 μL后離心、過(guò)濾，待分析；甲基叔丁基醚/甲醇層干燥物用乙腈/水(40∶60,體積比)復(fù)溶至120 μL后離心、過(guò)濾，待分析。

1.2.2 色譜條件強(qiáng)極性部分：采用Kinetex HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.6 μm；Phenomenex公司)；流動(dòng)相為乙腈(A)和水(含5 mmol/L乙酸銨，B)；流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為45 ℃。采用線性梯度洗脫：每次進(jìn)樣前用初始流動(dòng)相平衡8 min，0～25 min，5%～40%B；25～30 min，40%～5%B。

弱極性部分：采用ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm；Waters公司)；流動(dòng)相為水(含0.1%甲酸，A)和乙腈(B)；流速為0.25 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為40 ℃。采用線性梯度洗脫程序：每次進(jìn)樣前用初始流動(dòng)相平衡5 min，0～2.5 min，2%～60%B;2.5～8 min，60%B;8～10 min,60%～81%B;10～18 min,81%～100%B;18～24.9 min，100%B;24.9～25 min，100%～2%B。

1.2.3 質(zhì)譜條件強(qiáng)極性部分：離子源為電噴霧(ESI)源；采用正、負(fù)離子檢測(cè)模式；掃描模式為全掃描；掃描范圍：m/z100～1 000；質(zhì)量分辨率：120 000；噴霧電壓：3.8 kV(正離子模式)，-3.0 kV(負(fù)離子模式)；鞘氣：0.20 MPa；輔助氣：0.10 MPa；離子源溫度：350 ℃(正離子模式)，380 ℃(負(fù)離子模式)；離子傳輸管溫度:350 ℃。

弱極性部分：采用ESI源，正、負(fù)離子檢測(cè)模式；掃描模式為全掃描；掃描范圍：m/z100～1 000；質(zhì)量分辨率：120 000；噴霧電壓：3.8 kV(正離子模式)，-3.0 kV(負(fù)離子模式)；鞘氣:0.40 MPa；輔助氣：0.20 MPa；離子源溫度：350 ℃(正離子模式)，380 ℃(負(fù)離子模式)；離子傳輸管溫度:380 ℃。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理獲得正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的LC-(±)ESI-MS譜后，采用數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換軟件MSConvert將原始數(shù)據(jù)(.raw格式)轉(zhuǎn)換成為mzXML格式文件，并導(dǎo)入數(shù)據(jù)處理軟件XCMS進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊、峰填充及峰過(guò)濾，最終獲得包括質(zhì)荷比(m/z)、保留時(shí)間(Retention time)及其峰面積的二維數(shù)據(jù)陣。將上述二維數(shù)據(jù)陣導(dǎo)入SIMCA-P進(jìn)行主成分分析(PCA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

代謝組學(xué)的樣品前處理步驟對(duì)最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要[10-11]，提取代謝組信息時(shí)應(yīng)盡可能兼顧代謝物不同的理化性質(zhì)，最大程度地獲得生物樣本中包含的所有代謝物信息，保持代謝組的原始性和完整性，同時(shí)去除雜質(zhì)，使待測(cè)物與分析技術(shù)相匹配，提高檢測(cè)靈敏度。提取溶劑的種類、超聲時(shí)間、提取時(shí)間等參數(shù)均會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此本研究對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 提取溶劑的選擇在文獻(xiàn)調(diào)查的基礎(chǔ)上[12-17]，本研究以色譜峰數(shù)目、代表性代謝物的峰面積以及提取平行性為指標(biāo)，比較了二氯甲烷/甲醇/水(28∶41∶42，體積比)、MTBE/二氯甲烷/甲醇/水(63∶36∶30∶35，體積比)、MTBE/甲醇/水(100∶30∶35，體積比)作為提取溶劑時(shí)對(duì)腎臟組織中代謝物的提取效果。

圖1 不同溶劑提取獲得的色譜峰數(shù)目比較

首先，將正、負(fù)離子檢測(cè)模式下獲得的LC-MS原始譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)格式轉(zhuǎn)化及XCMS軟件進(jìn)行預(yù)處理，得到不同溶劑體系提取檢測(cè)到的色譜峰數(shù)目(如圖1)。結(jié)果顯示，MTBE/甲醇/水溶劑體系提取得到的色譜峰數(shù)目最多(共得到13 556個(gè)色譜峰,其中強(qiáng)極性部分6 956個(gè)，弱極性部分6 600個(gè))，其次是MTBE/二氯甲烷/甲醇/水溶劑體系(共得到11 125個(gè)色譜峰，其中強(qiáng)極性部分6 890個(gè)，弱極性部分4 235個(gè))，二氯甲烷/甲醇/水溶劑體系提取得到的色譜峰數(shù)目最少(共得到10 152個(gè)色譜峰，其中強(qiáng)極性部分5 773個(gè)，弱極性部分4 379個(gè))。

隨后對(duì)不同提取溶劑體系獲得的10種代表性代謝物的提取離子流色譜峰面積進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，MTBE/甲醇/水溶劑體系對(duì)腎臟中LysoPC(14∶0)、LysoPC(16∶0)、LysoPC(17∶0)、LysoPC(18∶2)和LysoPC(18∶0)等弱極性代謝物的提取效果顯著優(yōu)于其他兩種溶劑體系，對(duì)L-異亮氨酸、?；撬帷⒓∷?、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤和5-甲硫腺苷等強(qiáng)極性代謝物的提取效果也最優(yōu)，但與其他兩種溶劑體系的差別較小。

進(jìn)一步計(jì)算了各代表性代謝物提取離子流色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察了不同提取溶劑體系的提取平行性，結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可以看出，MTBE/甲醇/水溶劑體系提取得到的各代謝物色譜峰面積的RSD最小，大部分代謝物的RSD值小于15%，表明該溶劑體系對(duì)腎臟中代謝物的提取平行性最好。

綜上所述，本研究最終選擇MTBE/甲醇/水(100∶30∶35)作為提取溶劑。

表1 不同溶劑提取物L(fēng)C-(+)ESI-MS分析獲得的代表性代謝物色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.1.2 組織勻漿對(duì)提取效果的影響通過(guò)比較不勻漿與勻漿3 min條件下所獲得的色譜峰數(shù)目，考察了組織勻漿對(duì)于代謝物提取效率的影響。結(jié)果顯示，組織勻漿條件下，強(qiáng)極性部分和弱極性部分檢測(cè)到的色譜峰數(shù)目均顯著高于不勻漿條件下獲得的結(jié)果。上述結(jié)果表明，組織勻漿可顯著提高代謝物的提取效率。因此本實(shí)驗(yàn)采用高速分散機(jī)對(duì)腎臟組織粉末勻漿后再進(jìn)行溶劑提取，并選擇在冰浴條件下進(jìn)行組織勻漿以防止提取液溫度過(guò)高對(duì)代謝物造成破壞，具體程序如“1.2.1”所示。

2.1.3 超聲時(shí)間的選擇以提取到的色譜峰數(shù)目為指標(biāo)，考察了不同超聲時(shí)間(0、5、10、20 min)對(duì)代謝物提取效果的影響。結(jié)果表明，超聲0、5、10、20 min時(shí)，強(qiáng)極性部分可分別提取5 976、6 419、6 313和6 376個(gè)色譜峰，弱極性部分可分別提取5 391、5 619、6 132和6 272個(gè)色譜峰，共可分別提取11 367、12 038、12 445和12 648個(gè)色譜峰，表明超聲20 min提取的色譜峰數(shù)目最多，但與10 min差別不明顯。為避免超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)產(chǎn)生熱量而導(dǎo)致代謝物信息發(fā)生改變，最終選擇超聲提取時(shí)間為10 min。

2.1.4 渦旋提取時(shí)間的選擇本研究在代謝物提取過(guò)程中采用渦旋進(jìn)行輔助提取，并比較了不同渦旋時(shí)間(5、10、20 min)獲得的色譜峰數(shù)目。結(jié)果表明，渦旋提取5、10和20 min時(shí)，強(qiáng)極性部分可分別提取5 594、6 257和6 357個(gè)色譜峰，弱極性部分可分別提取5 349、5 541和6 339個(gè)色譜峰，共可分別提取10 943、11 798和12 696個(gè)色譜峰。綜合考慮，最終選擇渦旋時(shí)間為20 min。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化強(qiáng)極性部分選用Kinetex HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.6 μm)，弱極性部分選用ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，分別考察了進(jìn)樣體積、流速、梯度洗脫程序、柱溫等對(duì)色譜分離效果的影響。優(yōu)化后的總離子流色譜圖(TIC)如圖3所示，強(qiáng)極性部分在進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.30 mL/min，梯度洗脫時(shí)間為30 min，柱溫為45 ℃的條件下，各色譜峰的分離效果良好；弱極性部分在進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.25 mL/min，梯度洗脫時(shí)間為25 min，柱溫為40 ℃的條件下，各色譜峰的分離效果良好。

圖3 LC-(+) ESI-MS分析獲得腎臟代謝物的總離子流色譜圖

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化樣品測(cè)試前，采用質(zhì)譜校正液將質(zhì)譜的質(zhì)量精度校正在2個(gè)ppm以內(nèi)。選擇牛磺酸、肌酸、L-異亮氨酸、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲硫腺苷、LysoPC(14∶0)、LysoPC(16∶0)、 LysoPC(17∶0)、LysoPC(18∶0)和LysoPC(18∶2)10種對(duì)照品的混合溶液，采用蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣分析，對(duì)離子源噴霧電壓、鞘氣、輔助氣體、離子源溫度、離子傳輸管溫度等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以獲得最大的質(zhì)譜響應(yīng)和檢測(cè)靈敏度。

圖4 腎臟提取物在不同質(zhì)量分辨率條件下經(jīng)LC-(±)ESI-MS檢測(cè)到的色譜峰數(shù)目

此外，本研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜的質(zhì)量分辨率對(duì)方法的靈敏度和特異性有顯著影響[18]。腎臟提取物在不同質(zhì)量分辨率條件下(15 000、30 000、60 000、120 000和240 000)進(jìn)行LC-(±) ESI-MS分析檢測(cè)到的色譜峰數(shù)目如圖4所示。結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量分辨率從15 000增至120 000時(shí)，測(cè)得的色譜峰數(shù)目逐漸增多。推測(cè)可能是由于隨著質(zhì)量分辨率的提高，色譜未完全分離的分子量相近的共流出物在質(zhì)譜中獲得了分離。圖5為腎臟提取物弱極性部分在LC-(+) ESI-MS檢測(cè)模式下保留時(shí)間為8.26 min時(shí)共流出物的質(zhì)譜圖，由圖可知，質(zhì)量數(shù)相差0.03 Da的共流出物在質(zhì)量分辨率為15 000的條件下無(wú)法實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜分離，隨著質(zhì)量分辨率的提高，其分離情況顯著改善，從而可提高其檢測(cè)的特異性、信噪比和靈敏度。但當(dāng)分辨率從120 000增至240 000時(shí)，測(cè)得的色譜峰數(shù)目有所降低，推測(cè)可能與Orbitrap型高分辨質(zhì)譜儀的掃描速度會(huì)隨著質(zhì)量分辨率的增加而降低有關(guān)。綜合考慮特異性和靈敏度，選擇質(zhì)譜分辨率為120 000。最終優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.2.3”所示。

圖5 腎臟提取物弱極性部分在LC-(+) ESI-MS檢測(cè)模式下保留時(shí)間為8.26 min時(shí)共流出物的質(zhì)譜圖

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 儀器精密度取大鼠腎臟的凍干粉末，按“1.2.1”方法進(jìn)行提取，對(duì)同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行分析，分別計(jì)算10種代表性代謝物色譜保留時(shí)間和提取離子流色譜峰面積的RSD，對(duì)儀器精密度進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，各代謝物提取離子流色譜峰面積的RSD均小于10%(表2)。此外，各代謝物保留時(shí)間的RSD值小于5.0%。上述結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.2 方法精密度取大鼠腎臟的凍干粉末，按“1.2.1”方法進(jìn)行提取，平行制備QC樣本，每天進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3天，將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，同時(shí)計(jì)算不同極性的內(nèi)源性代謝物提取離子流色譜峰面積的RSD值，以評(píng)估方法的批內(nèi)和批間精密度。經(jīng)PCA分析后各樣本在第一主成分上的投影結(jié)果如圖6所示，18個(gè)QC樣本的偏差均在2SD范圍內(nèi)。各代謝物提取離子流色譜峰面積的批內(nèi)和批間RSD均不大于15%(表2)，此外保留時(shí)間的批內(nèi)和批間RSD小于15%。上述結(jié)果表明，所建立的方法具有良好的重復(fù)性，從而可保證測(cè)試樣本間的差異主要來(lái)源于不同處理組樣品中內(nèi)源性代謝物的差異，而不是由分析方法的誤差產(chǎn)生，因此本方法可用于腎臟代謝組學(xué)研究。

表2 LC-(±) ESI-MS方法的儀器精密度和方法精密度

3 結(jié) 論

本研究建立了基于液相色譜-超高分辨質(zhì)譜技術(shù)的腎臟代謝組學(xué)分析方法。該方法以MTBE/甲醇/水溶劑體系作為提取溶劑，采用親水色譜和反相色譜相結(jié)合的色譜分離系統(tǒng)對(duì)代謝物進(jìn)行分離，可同時(shí)獲取腎臟組織中的強(qiáng)極性和弱極性代謝物信息。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可為腎臟疾病和藥物腎毒性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供一種新方法。目前，該方法已應(yīng)用于藥物腎毒性代謝組學(xué)研究中。