翁 爽,王明超，應(yīng)萬濤,錢小紅

(中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，北京 102206)

臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究是通過發(fā)現(xiàn)不同病患和健康人之間的蛋白質(zhì)及其修飾水平的表達(dá)豐度差異，以實(shí)現(xiàn)疾病人群的分子分型，發(fā)現(xiàn)潛在的藥物干預(yù)靶標(biāo)和診斷標(biāo)志物。除體液外，常用的臨床樣本基本來自活檢、手術(shù)切除等獲得的組織。組織樣本主要分為兩種：新鮮/凍存和福爾馬林固定石蠟包埋(Formalin-fixed and paraffin-embedding，F(xiàn)FPE)組織樣本[1]，其中FFPE組織在常溫下可穩(wěn)定儲(chǔ)存數(shù)十年，是組織病理學(xué)分析的金標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。經(jīng)過一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)累積了大量的FFPE組織樣本。FFPE組織樣本的一個(gè)重要優(yōu)勢是具備長期的臨床隨訪信息，包括個(gè)體生活史、疾病分期、無病生存期和死亡時(shí)間等信息。這些信息對(duì)于多組學(xué)分析和目標(biāo)導(dǎo)向的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)踐異常重要，而這往往是新鮮凍存組織難以達(dá)到的。基于患者人群的FFPE組織開展差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可以充分利用罕見疾病或腫瘤等樣本，發(fā)現(xiàn)與疾病診斷、分型、預(yù)后及治療密切相關(guān)的靶蛋白。從技術(shù)角度，F(xiàn)FPE組織由于經(jīng)過甲醛固定、脫水和封蠟等處理，且通常只能獲得幾個(gè)微米厚度的切片，因此針對(duì)微量切片的FFPE組織蛋白質(zhì)提取和消化、質(zhì)譜分析等過程，本身又構(gòu)成了極大的挑戰(zhàn)。本綜述將首先概述針對(duì)FFPE組織切片蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)發(fā)展，隨后概括各種疾病尤其是腫瘤中差異蛋白和候選標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)研究。

1 FFPE組織切片樣本的制備方法

福爾馬林固定方法使組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)得到穩(wěn)定的保護(hù)，且與蘇木精和曙紅染色程序相容，因此成為病理組織保存的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。其基本流程為：手術(shù)獲得的組織清洗后立即用10%福爾馬林溶液(即40 g/L甲醛水溶液)固定24～48 h；取出后切成適當(dāng)厚度塊狀(通常為3 mm)，使用不同濃度乙醇水溶液和二甲苯脫水后，包埋在熔融的石蠟中并使其在室溫下固化，形成FFPE組織[1]。在組織病理學(xué)的研究中，常將FFPE組織切成3～10 μm的薄片并貼于載玻片上，用于后續(xù)分析。臨床樣本取材過程中的質(zhì)控和樣本固定流程的標(biāo)準(zhǔn)化，是影響FFPE組織切片蛋白質(zhì)表達(dá)譜穩(wěn)定性的兩個(gè)重要因素。因此在取材時(shí)將樣本進(jìn)行清洗以降低來自血液的污染，以及縮短手術(shù)后組織常溫放置時(shí)間，是FFPE組織樣本制備以及后續(xù)分析的關(guān)鍵。

2 FFPE組織切片樣本制備過程中的化學(xué)修飾

圖1 蛋白質(zhì)甲醛交聯(lián)的反應(yīng)機(jī)理[4]

上述化學(xué)修飾，在不同水平影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為：在一級(jí)結(jié)構(gòu)上對(duì)單個(gè)氨基酸產(chǎn)生影響，使氨基酸修飾發(fā)生改變或增加額外修飾；在二級(jí)結(jié)構(gòu)上對(duì)肽鏈的ɑ螺旋和β折疊以及不同片層產(chǎn)生修飾，或產(chǎn)生片層之間的交聯(lián)；在三級(jí)結(jié)構(gòu)上引起蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變(3D修飾)；在四級(jí)結(jié)構(gòu)上通過交聯(lián)聚合產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)的交聯(lián)復(fù)合物。這些影響使肽段的理化性質(zhì)發(fā)生改變，高級(jí)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)更會(huì)增加蛋白提取以及酶切的難度[5]。因而，選擇提取FFPE組織切片時(shí)的溶劑顯得尤其重要。

3 FFPE組織切片樣本蛋白的提取

FFPE組織來源的切片可直接進(jìn)行蛋白質(zhì)提取[6]，但主要挑戰(zhàn)之一是建立標(biāo)準(zhǔn)化高效的提取方案，從而實(shí)現(xiàn)微量FFPE組織中蛋白質(zhì)的提取。FFPE組織切片在蛋白提取前需要進(jìn)行脫蠟和重水化。常用脫蠟液為二甲苯，為了避免二甲苯的毒性，近年來有研究使用90～95 ℃的熱水替代二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟和重水化[7]。但該新方法目前尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化，二甲苯脫蠟和乙醇重水化仍然是FFPE組織切片進(jìn)行蛋白提取的標(biāo)準(zhǔn)操作。

FFPE組織切片樣本裂解和蛋白提取時(shí)，裂解液的成分以及樣本解交聯(lián)是關(guān)鍵。商業(yè)化的裂解液較多使用酸不穩(wěn)定表面活性劑RapiGest(Waters)[8-10]，以及商業(yè)試劑盒，如Liquid Tissue MS protein Prep kit[11-13]、Qproteome FFPE tissue kit[14]等。商業(yè)化裂解液和試劑盒對(duì)蛋白提取的重現(xiàn)性較高，但其具體成分并不知曉，這將影響后續(xù)分析方法的建立。自制裂解液的種類較多，中性或堿性pH可提高組織蛋白的產(chǎn)率，此外更高的pH在理論上更能促進(jìn)亞甲基橋的斷裂，因此常選用pH值4～9的Tris-HCl和十二烷基磺酸鈉(SDS)緩沖液進(jìn)行組織樣本蛋白的提取[15-16]。Fowler等[17]通過大量比對(duì)，證明了SDS對(duì)FFPE組織蛋白提取的有效性。Broeckx等[18]對(duì)比了8種不同蛋白裂解液的提取效率，闡明了在提取液中加入2% SDS后，蛋白的回收率提高了15倍。目前，SDS已成功應(yīng)用于結(jié)直腸癌、肺腺癌等疾病FFPE組織樣本的蛋白提取，以及后續(xù)的質(zhì)譜分析[15，19]。但需要注意的是，過高濃度的SDS可能會(huì)影響蛋白的溶解以及酶切和分離效率，這種干擾效應(yīng)可通過后續(xù)的肽段消化過程消減[15-16，20]。

盡管諸多裂解液之間存在差異，但普遍使用加熱解交聯(lián)提高蛋白提取的效率。這種技術(shù)基于Shi等[21]1991年創(chuàng)建的“熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)”(Heat-induced antigen retrieval，HIAR)方法，其基本過程是將FFPE組織切片樣本用合適的裂解液溶解后，在90～120 ℃下加熱10 min至數(shù)小時(shí)。HIAR水解亞甲基橋，從而切斷蛋白之間的交聯(lián)。通常情況下，溫度越高達(dá)到相同質(zhì)量的解交聯(lián)所需的時(shí)間越少，但目前尚無達(dá)到100%解交聯(lián)的實(shí)驗(yàn)方案[22]。

4 FFPE組織切片蛋白質(zhì)的消化

利用蛋白酶消化蛋白質(zhì)提取物，進(jìn)而產(chǎn)生肽段是蛋白質(zhì)組樣本制備中必不可少的步驟。由于質(zhì)譜儀與裂解液中部分試劑的不相容性，對(duì)于FFPE組織切片樣本，早期常用的消化方法是膠內(nèi)酶切和溶液酶切。這兩種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是與裂解液中的去垢劑(尤其是SDS)相容，可在質(zhì)譜上樣前將SDS等去垢劑去除[18，23-24]。但膠內(nèi)酶切的缺點(diǎn)是肽的回收率較低[16]，溶液酶切則需對(duì)樣本進(jìn)行脫鹽以減小對(duì)質(zhì)譜的影響，而這些對(duì)微量樣本都是異常嚴(yán)峻的問題。

Wisniewski等[25]于2009年描述了一種稱為過濾器輔助樣品制備(Filter aided sample preparation，F(xiàn)ASP)的酶切技術(shù)，該方法使用膜過濾器進(jìn)行裂解液中SDS/尿素的替換。此后，Wisniewski等[16]于2011年進(jìn)一步比較了用FASP和膠內(nèi)酶切來處理微量的全細(xì)胞裂解液，結(jié)果表明FASP獲得的肽段產(chǎn)率高于50%，而膠內(nèi)酶切平均低于20%；當(dāng)樣本量低于10 μg時(shí)向裂解液中加入聚乙二醇20000(PEG20000),使肽段回收率提高了30%。Tanca等[20]于2014年對(duì)肝臟FFPE組織樣本進(jìn)行了溶液酶切、FASP酶切、直接組織酶切(DT)的比較，發(fā)現(xiàn)FASP酶切得到的鑒定量最高(3種方法分別鑒定到1 616、2 076、1 940種蛋白)。近年出現(xiàn)了一種提取FFPE組織切片中的蛋白質(zhì)并進(jìn)行后續(xù)酶切的新方法：對(duì)單片F(xiàn)FPE組織切片進(jìn)行裂解，在高溫加熱和超聲裂解后，調(diào)節(jié)pH至7～8，直接酶切(Direct trypsinization，DTR)[8-10]。該方法的蛋白鑒定量與FASP相當(dāng)，且具有與各種經(jīng)典組織學(xué)染色使用的染料兼容和酶切前的處理步驟較少的優(yōu)點(diǎn)，比FASP更適合大規(guī)模樣本的處理；但其酶消化的漏切率較高，提取的蛋白偏性較大，非胰蛋白酶消化肽也較多[8，20]。Taverna等[26]于2019年提出了一種最新的酶切方法，即直接將微型化的聚合物凝膠置于FFPE組織切片區(qū)域上進(jìn)行局部消化，該方法能夠區(qū)分組織區(qū)域，檢出區(qū)域間的差異表達(dá)蛋白。

綜上所述，目前最常用的FFPE組織切片消化方法是加入胰蛋白酶進(jìn)行FASP酶切，新型的酶切方法和蛋白酶聯(lián)用技術(shù)也在逐步發(fā)展。胰蛋白酶仍是最常使用的蛋白酶[27]，其對(duì)FFPE組織切片樣本的蛋白鑒定最有利，將其與其它種類酶進(jìn)行聯(lián)用，可在一定程度上提高蛋白的鑒定量[15，28]。而FASP酶切具備較好的兼容性，在保證肽段產(chǎn)率以及低漏切率的同時(shí)，可以獲得最高的鑒定量[8，16,20]。

5 激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割(Laser capture microdissection，LCM)技術(shù)是在保存要捕獲的細(xì)胞和其周圍組織形態(tài)完整的前提下，直接從組織切片中獲取目標(biāo)細(xì)胞。LCM與染色搭配，可以選擇性獲取組織塊中特定區(qū)域[29]。FFPE組織的完整結(jié)構(gòu)與LCM相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)局部區(qū)域的精確和可重復(fù)的空間分離，在一定程度上可以消除腫瘤樣本的異質(zhì)性[30]。通過LCM收集FFPE組織切片樣本，以獲得純度較高的細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)組分，開展更為精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)組分析，已經(jīng)成為一種發(fā)展趨勢。Wood[31]于2017年利用LCM從快速進(jìn)展性阿爾茨海默癥(rpAD)和典型散發(fā)性AD(sAD) FFPE腦組織切片中分離淀粉樣斑塊，確定了兩種疾病之間差異表達(dá)的141種蛋白質(zhì)。Alrawashdeh等[32]于2019年用LCM收集神經(jīng)浸潤(PNI)和非神經(jīng)浸潤的胰腺導(dǎo)管癌上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了PNI表達(dá)改變的蛋白。Eckert等[33]通過LCM從卵巢癌FFPE組織切片中收集約5 000個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，平均每個(gè)樣本定量鑒定4 428種蛋白。

6 FFPE組織切片來源肽段生物質(zhì)譜分析

FFPE切片樣本蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展前期均以數(shù)據(jù)依賴性采集(DDA)模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，上述研究皆是樣本預(yù)分離結(jié)合DDA方法進(jìn)行質(zhì)譜分析。DDA方法的蛋白鑒定靈敏度高，但其樣本檢測時(shí)有一定隨機(jī)性，會(huì)降低蛋白質(zhì)組學(xué)的采樣深度[35-36]。樣本預(yù)分離結(jié)合DDA的方法雖可以增加蛋白質(zhì)組覆蓋度，但也會(huì)增加時(shí)間和資源的浪費(fèi)，以及樣本間的變異性。非數(shù)據(jù)依賴采集(DIA)模式則是將特定窗口內(nèi)所有母離子進(jìn)行碎裂，實(shí)現(xiàn)了樣本中肽段信號(hào)的全譜圖化記錄，包括各種可能的翻譯后修飾形式，從而實(shí)現(xiàn)了FFPE組織切片的數(shù)字化信息記錄[37]。Wojcik等[38]于2019年對(duì)惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤(MPNST)FFPE組織樣本和細(xì)胞系分別進(jìn)行DDA和DIA數(shù)據(jù)采集，DDA數(shù)據(jù)無法可靠區(qū)分共洗脫物質(zhì)，而細(xì)胞DIA數(shù)據(jù)中多梳復(fù)合物2(PRC2)與腫瘤中結(jié)果高度吻合，從而發(fā)現(xiàn)PRC2在發(fā)病機(jī)制中的作用。Azimi等[39]采用DIA分析正常皮膚和角質(zhì)細(xì)胞病變(KSL)的FFPE樣品，從93個(gè)樣本中定量了3 574種蛋白質(zhì)，并找到了可以區(qū)分疾病的差異表達(dá)蛋白。Kim等[13]則采用FFPE腫瘤活檢組織的全蛋白質(zhì)譜，將兩種胃癌樣本從結(jié)直腸癌樣本中分離出來，并鑒定了特征蛋白(Signature proteins)。

DDA方法是目前FFPE組織切片樣本的主要數(shù)據(jù)采集方法，DIA方法的優(yōu)勢在于其一針進(jìn)樣檢測，即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的深度定量。由于方法本身的特性，DIA采集的數(shù)據(jù)覆蓋了更為全面的信息，對(duì)與疾病關(guān)聯(lián)的研究更加有利。因此，未來DIA方法可能會(huì)成為FFPE組織樣本蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主流技術(shù)。

7 FFPE樣本的翻譯后修飾研究

FFPE組織也可用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究。Lai等[40]利用小鼠肝臟組織進(jìn)行了FFPE樣本和新鮮/凍存樣本的比較，結(jié)果顯示兩種樣本中的磷酸化翻譯后修飾相似。Hinneburg等[41]從少量的FFPE樣本中釋放出N-和O-聚糖，并用于質(zhì)譜分析，可得到單個(gè)聚糖的詳細(xì)信息。Wang等[19]從肺腺癌患者的FFPE組織切片中鑒定出58種N-聚糖成分，與正常人進(jìn)行對(duì)比，鑒定出肺腺癌患者中差異表達(dá)的糖修飾(即高甘露糖型N-聚糖上調(diào)，唾液酸化的N-聚糖下調(diào))。Holfeld等[42]從FFPE和最佳溫度冷凍切割的膀胱癌樣本中各鑒定出250和400個(gè)磷酸化位點(diǎn)，表明長期儲(chǔ)存臨床樣品仍可用于磷酸化修飾的檢測。上述研究表明，F(xiàn)FPE組織樣本處理過程并不影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究。

8 基于FFPE樣本的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究

臨床FFPE組織樣本庫中包括了大量罕見和常見疾病(如惡性腫瘤患者的組織樣本)，是蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的寶貴資源[43]。通過比較不同疾病組織與正常組織，可識(shí)別潛在的生物標(biāo)志物。FFPE組織樣本處理技術(shù)及質(zhì)譜策略目前已用于許多組織器官的疾病研究以及潛在疾病生物標(biāo)志物的尋找。表1列舉了部分從2016年起通過FFPE組織樣本在腫瘤中尋找潛在生物標(biāo)志物和藥靶的應(yīng)用，包括甲狀腺癌[44]、小細(xì)胞肺癌[12]、卵巢癌[6，33]、結(jié)直腸癌[45-46]、腎透明細(xì)胞癌[47]、膀胱尿路上皮癌[48-49]、實(shí)體瘤[50]等疾病。

表1 腫瘤FFPE組織樣本研究中發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)志物(部分)

9 總結(jié)與展望

FFPE組織切片樣本的標(biāo)準(zhǔn)化制備、高存儲(chǔ)量、豐富的臨床回顧性信息等優(yōu)勢，使其成為疾病生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的豐富資源。在過去數(shù)十年中，F(xiàn)FPE組織切片蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法獲得了系列的發(fā)展，隨著裂解液的優(yōu)化以及蛋白提取方法的發(fā)展，在樣本解交聯(lián)的同時(shí)可以達(dá)到更高效的蛋白提取。同時(shí)，在保證質(zhì)譜兼容性的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了高效的樣本消化。方法的發(fā)展推進(jìn)了FFPE蛋白質(zhì)組學(xué)逐步應(yīng)用于腫瘤等重大疾病的研究，并發(fā)現(xiàn)了系列候選標(biāo)志分子(表1)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在速度、靈敏度、通量化水平的更高更快發(fā)展，基于FFPE組織切片的精準(zhǔn)蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用還將繼續(xù)深入發(fā)展。同時(shí)，對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的候選標(biāo)志物，利用豐富的FFPE樣本庫，開展大規(guī)模的驗(yàn)證工作，也將是未來一段時(shí)間FFPE組織樣本應(yīng)用的一個(gè)重要內(nèi)容，并將有利于推進(jìn)更為精準(zhǔn)、高效、實(shí)用的生物標(biāo)志物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。