張佳玲
(德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校 化學(xué)系,德克薩斯 奧斯汀 78712,美國)
近年來,質(zhì)譜技術(shù)憑借其本身具有的靈敏度高、特異性強和分析速度快的優(yōu)勢,在臨床診斷中的應(yīng)用越來越廣泛。質(zhì)譜在臨床領(lǐng)域,如新生兒疾病篩查[1]、甾體激素檢測[2]、微生物檢測[3]、呼吸物檢測[4]等中的應(yīng)用,相關(guān)綜述均進(jìn)行了詳盡闡述。目前,質(zhì)譜在腫瘤診斷方面常見的技術(shù)主要包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry,MALDI-MS)。自2004年常壓敞開式離子化質(zhì)譜(AIMS)被報道以來,該技術(shù)領(lǐng)域近幾年在腫瘤診斷中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。在過去的多年間,已有多篇AIMS相關(guān)的綜述報道[5-6]。本文結(jié)合前期研究工作,主要針對不同AIMS技術(shù)在人體腫瘤,尤其是腫瘤診斷中的研究進(jìn)行了總結(jié),并展望了該技術(shù)在未來發(fā)展的可能趨勢。
Cooks課題組于2004年報道了具有開創(chuàng)意義的解吸附電噴霧離子化質(zhì)譜(Desorption electrospray ionization mass spectrometry,DESI-MS)[7]。目前DESI技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個不同的領(lǐng)域,并且有多篇綜述對其進(jìn)行了總結(jié)[6,8-9]。最早見于報道的將DESI-MS應(yīng)用于癌癥組織分析是在2005年,Wiseman等[10]對人肝腺轉(zhuǎn)移癌進(jìn)行了分析,在正離子模式下,DESI-MS質(zhì)譜圖顯示肝癌組織樣品中鞘磷脂的峰強度高于正常組織樣品。2009年,DESI-MS對人體乳腺癌樣品的組織成像首見報道[11]。目前,DESI-MS是最廣泛地被應(yīng)用于人類癌癥組織分析的技術(shù)之一,其應(yīng)用涉及乳腺癌[12]、腦癌[13-17]、肝癌[10]、前列腺癌[18-19]、腎癌[20]、膀胱癌[20]、胃癌[21-22]、結(jié)直腸癌[23-24]、甲狀腺癌[25]、皮膚癌[26]、肺癌[27-28]及淋巴轉(zhuǎn)移癌[21,29]等。需指出的是,以上應(yīng)用均處于研究階段,并未經(jīng)美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn),因此均未被應(yīng)用于實際臨床診斷。
再帕爾·阿不力孜課題組于2011年報道了空氣動力輔助離子化技術(shù)(Air flow-assisted ionization,AFAI),也稱為空氣動力輔助解吸附電噴霧離子化技術(shù)(Air flow-assisted desorption electrospray ionization,AFADESI),該技術(shù)可實現(xiàn)開放環(huán)境下離子的遠(yuǎn)距離傳輸,消除樣品檢測的空間限制和增加分析的靈活性[30]。在腫瘤組織診斷方面,該實驗室也對不同疾病展開了研究。2015年,Li等[31]利用AFADESI對52個人肺癌樣品進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了脂類、氨基酸、膽堿、多肽以及左旋肉堿等生物標(biāo)記物,并且靈敏度和特異性可分別達(dá)到93.5%和100%。2016年,Mao等[32]利用AFADESI對乳腺癌中2種非常重要的乳腺導(dǎo)管原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌進(jìn)行了區(qū)分。而在最近,Sun等[33]通過對256例食管癌病人的分析,詳細(xì)討論了來自不同代謝通路的多種代謝物分子。值得一提的是,研究者發(fā)現(xiàn)Pyrroline-5-carboxylate reductase 2(PYCR2)和Uridine phosphorylase 1(UPase1)這2個代謝通路與食道鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)。
在DESI成像方面,本課題組在過去幾年間分別對胃癌,嗜酸細(xì)胞瘤和甲狀腺癌展開了研究。2012年,Eberlin等[22]對術(shù)中胃癌組織快速冷凍樣品進(jìn)行了分析,以幫助外科醫(yī)生術(shù)中快速診斷,為確認(rèn)癌癥邊緣提出了新的解決方案。該研究對62例組織庫的人胃部樣品進(jìn)行分析,通過統(tǒng)計學(xué)方法對所獲得的12 480個質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練,尋找重要的生物標(biāo)記物,建立統(tǒng)計學(xué)預(yù)測模型,經(jīng)過一系列優(yōu)化,可獲得近98%的準(zhǔn)確率。不僅如此,利用該統(tǒng)計學(xué)模型,對21例實際術(shù)中胃部邊緣樣品進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示可以獲得與病理學(xué)專家相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。
嗜酸細(xì)胞瘤(Oncocytic tumor)是一類少見的良性腫瘤,細(xì)胞層面表現(xiàn)為線粒體的過度積累。已有研究表明,這類腫瘤的發(fā)生與線粒體DNA的突變相關(guān),然而對于該類腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)分子信息的研究目前尚未見報道。利用DESI質(zhì)譜成像,本實驗室對正常甲狀腺樣品、嗜酸細(xì)胞瘤和非嗜酸細(xì)胞瘤3種不同的樣品組織進(jìn)行了分析[25]。結(jié)果顯示,在嗜酸細(xì)胞瘤中有一類特殊的分子——心磷脂在其中的含量遠(yuǎn)高于另外2種組織。心磷脂分子相比于其他脂類分子的特殊之處在于它可同時攜帶2個電荷。此外,研究還發(fā)現(xiàn)了17種被氧化的心磷脂分子,且只存在于嗜酸細(xì)胞瘤中。采用不同的染色方法交叉驗證質(zhì)譜的實驗結(jié)果,如免疫組織化學(xué)染色法(Immunohistochemistry,IHC)和熒光染色,均得到與質(zhì)譜成像一致的結(jié)果(圖1)。
圖1 DESI成像和甲狀腺線粒體分離實驗流程[25]
甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)病率近些年在許多國家逐年攀升。然而,臨床上對該疾病穿刺樣品是否為癌癥的診斷仍較為困難,由于樣品中細(xì)胞數(shù)量較低或形態(tài)不規(guī)則,占該類疾病20%的樣品往往只能夠給出不確定的診斷結(jié)果。盡管基因組技術(shù)逐漸被應(yīng)用于該類疾病的診斷,但效果仍然有限。本實驗室通過對178個病人組織樣品,包括正常組織、良性濾泡狀腺瘤(Benign follicular adenoma,F(xiàn)TA)、惡性濾泡狀腺瘤(Malignant follicular carcinoma,F(xiàn)TC)和乳突癌(Papillary carcinoma,PTC)使用DESI成像技術(shù)進(jìn)行分析,共獲得了114 125個質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)[34],對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練,所獲得的統(tǒng)計學(xué)模型被用來預(yù)測臨床上的穿刺樣品,可得到大約90%的預(yù)測準(zhǔn)確率,證明了質(zhì)譜成像不僅可用于組織樣品分析,在細(xì)胞分析上也有其獨特的應(yīng)用。
基于探針的質(zhì)譜技術(shù)研究在近幾年逐漸引人關(guān)注,其基本原理存在一定相似之處,即均需制作帶有尖端的探針。早在1999年,中山大學(xué)謝建臺課題組[35]就報道了無需毛細(xì)管,只需銅線即可產(chǎn)生電噴霧的離子化裝置。2010年,歐陽證課題組[36]報道了紙噴霧離子化(PS)質(zhì)譜。PS的工作原理是將紙剪成帶有尖端的形狀,將所要分析的樣品在紙片上進(jìn)行上樣,當(dāng)在紙片上滴加溶劑并施以高壓時,紙片尖端會產(chǎn)生電噴霧,從而將樣品離子化。PS被廣泛用于血液、尿液、唾液、糞便等樣品的分析[37-38]。此后,一系列相似原理的技術(shù)相繼被報道。2013年,Mandal等[39]使用探針電噴霧(Probe electrospray ionization,PESI)對4例正常和癌變的結(jié)腸樣品進(jìn)行分析,通過主成分分析可清晰地將兩者區(qū)分。2015年,Kerian等[40]在前列腺組織樣品表面使用棉棒進(jìn)行簡單接觸,通過指診噴霧(Touch spray)對來自6個前列腺病人的70個樣品進(jìn)行非靶向分析,最終所獲得的110個數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率為93%。2017年,Pirro等[41]利用指診噴霧對29個人體膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行了分析,在指診噴霧的圖譜中可清晰地觀察到重要的生物標(biāo)記物N-Acetylaspartate(NAA)。而對2-Hydroxyglutarate(2HG)的表征則可以用來評估Isocitrate dehydrogenase(IDH)突變的狀態(tài),因此該方法在手術(shù)中的快速診斷方面具有很大的應(yīng)用潛力。在基于探針的方法中,還有一種方法為生物組織噴霧(Tissue spray),該方法直接利用樣品組織在尖端產(chǎn)生噴霧而將樣品離子化。Kononikhin等[42]使用該方法,利用豐富的脂質(zhì)信息,對人體腦壞死組織和腦瘤組織的質(zhì)譜圖進(jìn)行了對比,證明了該方法具有區(qū)分不同組織的潛力。2015年,Wei等[43]使用38組人體肺部樣品,通過組織噴霧,對肺部鱗狀細(xì)胞癌(Lung squamous cell carcinoma)以及相鄰正常組織進(jìn)行了分析,在統(tǒng)計學(xué)方法的輔助下,使用偏最小二乘判別分析(Partial least squares linear discriminant analysis,PLS-LDA),對癌癥的判別準(zhǔn)確率達(dá)94.42%,并且整個分析過程可在1 min內(nèi)完成。2018年,Adamyan等[44]使用組織噴霧對子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis)、腹膜子宮內(nèi)膜異位癥和正常子宮內(nèi)膜3種樣品進(jìn)行了質(zhì)譜表征,并討論了3種組織中具有顯著差異的15種不同的脂類分子。
2009年,Zoltan實驗室[45-46]報道了一種快速揮發(fā)電離質(zhì)譜(Rapid evaporative ionization mass spectrometry),也稱為智能手術(shù)刀(iKnife)。該技術(shù)的工作原理是:首先對所要分析的樣品進(jìn)行電燒蝕(Cauterization),電燒蝕過程中會產(chǎn)生含有樣品的氣溶膠,通過文丘里空氣泵(Venturi pump)將氣溶膠導(dǎo)入自制的離子源中進(jìn)行離子化,最終進(jìn)入質(zhì)譜,從而得到待分析樣品的分子信息。2017年,St John等[47]利用iKnife對多發(fā)性乳腺癌展開了研究,該研究中對正常乳腺組織樣品和腫瘤組織使用線性判別分析(Linear discriminant analysis,LDA)建立了統(tǒng)計學(xué)模型,932個樣品數(shù)據(jù)可獲得93.4%的靈敏度和94.9%的特異性。利用該模型,對另外161個正常樣品和99個腫瘤樣品進(jìn)行了預(yù)測,獲得了90.9%的靈敏度和98.8%的特異性。該技術(shù)術(shù)中操作以及數(shù)據(jù)分析過程可在短短的1.8 s內(nèi)完成。2018年,Phelps等[48]對來自198例人體卵巢癌的335個樣品組織進(jìn)行了分析,交叉驗證結(jié)果顯示對正常卵巢樣品和卵巢癌樣品的辨別可達(dá)到97.4%的靈敏度和100%的特異性。而對具有非常重要臨床意義的卵巢癌邊緣樣品的鑒別,靈敏度和特異性仍高達(dá)90.5%和89.7%。此外,該研究還發(fā)現(xiàn)了5個磷脂酸和磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)分子在卵巢癌樣品中的含量遠(yuǎn)高于正?;蛘哌吘壜殉矘悠?。
SpiderMass是在2016年被Fourier實驗室報道[49]的基于激光的質(zhì)譜分析技術(shù)。Fatou等認(rèn)為該技術(shù)的工作原理是通過使用共振紅外激光對所要分析的樣品進(jìn)行解吸附,樣品本身存在的水分子作為基質(zhì),以類似于基質(zhì)輔助激光解吸/電離的過程產(chǎn)生離子,借助質(zhì)譜本身的真空直接被導(dǎo)入質(zhì)譜。在首篇報道中,采用SpiderMass對人體的皮膚進(jìn)行了分析,并對采集的不同性別數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析。2018年,Saudemont等[50]采用該技術(shù)對體外犬類肉瘤組織進(jìn)行了研究,并對正常、腫瘤和壞死組織進(jìn)行了區(qū)分和鑒定,準(zhǔn)確率高達(dá)97.63%。此外,還對發(fā)現(xiàn)的可能生物標(biāo)記物進(jìn)行了多級質(zhì)譜以及質(zhì)譜成像分析。
2015年,Zarrine-Afsar實驗室利用皮秒紅外激光(Picosecond infrared laser,PIRL)在切除組織時不會造成熱損傷這一特性,將其與電噴霧相結(jié)合(PIRL-LAESI)對生物樣品進(jìn)行分析[51],發(fā)現(xiàn)PIRL的垂直分辨率為20~30 μm,水平分辨率約100 μm,且該技術(shù)可同時獲得脂質(zhì)分子和蛋白質(zhì)分子的質(zhì)譜信號。2017年,Woolman等[52]將該裝置進(jìn)一步簡化,使用手持式PIRL激光裝置,再通過聚四氟乙烯導(dǎo)管與質(zhì)譜直接相連,將產(chǎn)生的離子最終導(dǎo)入質(zhì)譜分析儀。最近,Woolman等[53]探究了使用PIRL-MS對髓母細(xì)胞瘤利用分子信息做術(shù)中快速判斷腫瘤亞類的可能,研究對來自113個病人的樣品進(jìn)行分組,其中71例為訓(xùn)練組,42例為獨立驗證組,使用主成分分析-線性判別分析(Principal component analysis with linear discriminant analysis,PCA-LDA),訓(xùn)練組的預(yù)測準(zhǔn)確率可達(dá)95%,驗證組的預(yù)測準(zhǔn)確率高達(dá)98.9%。
在AIMS領(lǐng)域中,利用液相固相萃取原理的技術(shù)包括液體表面萃取分析(Liquid extraction surface analysis,LESA)[54]和液體微界面表面取樣探針(Liquid microjunction-surface sampling probe,LMJ-SSP)[55]。 然而,以上技術(shù)在腫瘤組織分析方面的相關(guān)工作鮮見報道。2017年,本實驗室報道了一項名為質(zhì)譜筆的技術(shù),利用該技術(shù)主要針對腫瘤組織診斷開展了相關(guān)研究工作。
2017年,本實驗室報道了可用于ex vivo或者in vivo生物樣品癌癥診斷的質(zhì)譜筆(MasSpec pen)技術(shù)[56]。質(zhì)譜筆的工作原理是:首先筆的末端與樣品表面接觸,通過腳踏板的觸發(fā),由注射泵自動在筆末端的凹槽內(nèi)以脈沖的方式注射一滴10 μL水滴,該水滴與樣品進(jìn)行3 s的萃取后,含有生物樣品分子的水滴會通過直接連接質(zhì)譜進(jìn)樣口的管路,在未經(jīng)過外接離子源的情況下,直接進(jìn)入質(zhì)譜中被離子化(圖2)。需指出的是,該技術(shù)的離子化機(jī)理尚不完全清楚,仍有待研究。研究分析了20例人體樣品的組織切片以及253例人體組織樣品,包括甲狀腺、肺、乳腺以及卵巢的正常和癌癥樣品。在不同人體樣品中,質(zhì)譜筆可檢測到豐富的分子信息,包括低分子量的代謝物分子、脂類,甚至是蛋白分子。采用統(tǒng)計學(xué)方法對所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示對正常組組織和癌癥組織區(qū)分的靈敏度和特異性分別達(dá)到96.4%和96.2%,準(zhǔn)確率為96.3%。最后,對活體小鼠進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)分析過程不會對小鼠造成任何明顯的損傷。
圖2 質(zhì)譜筆裝置示意圖[56]
卵巢癌是一類具有轉(zhuǎn)移性并且致死率較高的癌癥,尤其以高分化漿液性卵巢癌(High-grade serous carcinoma,HGSC)和低分化漿液性卵巢癌(Low-grade serous carcinoma,LGSC)最為常見。本實驗室利用最近發(fā)明的質(zhì)譜筆技術(shù)(圖3)對該疾病展開了詳細(xì)研究[57],對138個卵巢樣品(71個正常,60個HGSC,7個LGSC)進(jìn)行了分析。統(tǒng)計學(xué)模型顯示,對于正常和HGSC的區(qū)分可獲得96.7%的靈敏度和95.7%的特異性,對于正常和所有分析的癌癥組織的區(qū)分可獲得94.0%的靈敏度和94.4%的特異性。值得一提的是,該研究還對高分辨Orbitrap和低分辨的離子阱2種高低端儀器進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)使用分辨率較低的質(zhì)譜對于20個正常卵巢樣品和20個HGSC樣品可以得到100%的準(zhǔn)確率。
圖3 質(zhì)譜筆對卵巢樣品的分析[57]
AIMS具有簡單,可在開放環(huán)境下操作,無需或者只需很少的樣品制備等優(yōu)勢,經(jīng)過多年的發(fā)展,已經(jīng)成功應(yīng)用于眾多生物、化學(xué)分析領(lǐng)域,尤其是臨床領(lǐng)域研究。需再次指出的是,目前還沒有一項AIMS技術(shù)得到美國食品藥品管理局FDA的認(rèn)證。已報道的AIMS方法有30多種,并且科學(xué)家仍然在不斷地對離子化裝置進(jìn)行改進(jìn),以提高易用性和自動化。本文針對幾種不同類型的AIMS技術(shù),結(jié)合本實驗室的研究,對其在腫瘤診斷中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)和整理。未來將AIMS應(yīng)用于臨床仍然任重道遠(yuǎn),面臨如定量能力、基質(zhì)效應(yīng)、數(shù)據(jù)的代表性/指紋圖譜的可靠性等一些嚴(yán)峻的問題。AIMS與傳統(tǒng)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可形成優(yōu)勢互補,存在的問題可以相互佐證。未來隨著AIMS技術(shù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的增強,結(jié)合目前的大數(shù)據(jù)分析,相信AIMS的穩(wěn)定性和可靠性也一定會進(jìn)一步得到提升。此外,小型化質(zhì)譜已經(jīng)成為目前該領(lǐng)域研究的最熱點之一。將AIMS的原位分析能力與小型質(zhì)譜的便攜功能結(jié)合,將會極大地促進(jìn)該技術(shù)在臨床領(lǐng)域中的應(yīng)用。