(1．皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室, 安徽 蕪湖 241002；2．安徽師范大學(xué)基因疾病與健康生物醫(yī)學(xué)安徽普通高校重點實驗室,安徽省重要生物資源保護與利用重點實驗室,安徽省中藥日化產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心, 安徽 蕪湖 241000)

0 引 言

微衛(wèi)星標(biāo)記(Microsatellite)，又稱簡單重復(fù)序列(Simple Sequences Repeats，SSRs)。廣泛存在于原核生物以及真核生物的基因組中，通常位于基因組的非編碼區(qū)中。

玉竹是百合科黃精屬多年生草本植物，主要分布在長江流域[1]，是一種重要的藥用植物，具有養(yǎng)陰清熱、生津止咳功效，因此被廣泛種植并應(yīng)用于中藥制作。近年來，有報道稱，來自玉竹根狀莖的同質(zhì)異黃酮可能能夠抑制高級糖基化終產(chǎn)物的形成，因此，這種植物可以作為一種新型的自然產(chǎn)品來減輕糖尿病并發(fā)癥[2]。此外，玉竹根狀莖常被用作冠狀動脈心臟病、糖尿病、肺結(jié)核和再生障礙性貧血等疾病的輔助療法。玉竹還具有很強的觀賞性，是不可多得的觀賞佳品。我國醫(yī)藥業(yè)對玉竹的需求量非常巨大，然而，大量的森林砍伐和環(huán)境變化導(dǎo)致玉竹野生種群數(shù)量急劇下降。

玉竹的形態(tài)已經(jīng)被廣泛的研究，包括花粉形態(tài)[3]，核型和細(xì)胞分類學(xué)[4]。雖然有兩種黃精屬的多態(tài)性微衛(wèi)星位點的報道[5～6]，但還沒有針對玉竹微衛(wèi)星引物的報道。為了分析玉竹自然種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，本文描述了核微衛(wèi)星標(biāo)記物[7]的發(fā)展。為今后保護和合理利用玉竹資源具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

選取安徽省岳西縣鷂落坪自然保護區(qū)11個玉竹樣品，云南省昆明9個玉竹樣品，安徽省瑯琊山20個玉竹樣品為材料。新鮮葉片經(jīng)硅膠干燥后于-20 ℃保存。選取玉竹干燥后的葉片樣品，經(jīng)液氮研磨，提取新鮮葉片基因組DNA。

1.2 方 法

1.2.1 基因組的提取和酶切

采用改良CTAB法提取玉竹葉片中基因組DNA[8]，運用磁珠富集法[9～11]，對多態(tài)微衛(wèi)星位點進行了分離和鑒定。本實驗所提取的玉竹基因組DNA需要檢測其濃度以及純度，這一進程需要使用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳，提取的DNA在-20℃下保留備用，再利用限制性內(nèi)切酶Sau3AI對500 ng基因組DNA進行酶切。PCR反應(yīng)體系(20 μl)為：DNA 1 μl，10 x Buffer 2 μl，Sau 3AI酶1 μl，無菌水補充至20 μl，用瓊脂糖凝膠純化試劑盒對300～900 bp的產(chǎn)物進行純化。

1.2.2 酶切產(chǎn)物與接頭連接和富集微衛(wèi)星片段

由兩個接頭OligoA(5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’)和OligoB(5’-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’)將上一步中純化的片段連接起來。連接引物的DNA片段在95 ℃下變性10 min，雜交化的單鏈3’親和素標(biāo)記的(CT)15Oligo探針在65℃下退火30min,在磁珠懸浮液中加入“微衛(wèi)星探針-包括微衛(wèi)星DNA的單鏈DNA”復(fù)合體，充分搖勻，室溫擱置30 min，在擱置期間需間斷輕輕搖勻，將懸浮狀態(tài)的磁珠沉淀下來。通過上述方法得到單鏈DNA片段，需經(jīng)過PCR擴增將其恢復(fù)為DNA雙鏈，另外為了后續(xù)的TA克隆做充足準(zhǔn)備，需通過GoTaq⑧DNA聚合酶在其末端加A。PCR反應(yīng)體系如下：

25μlPCR富集反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序如下：94°C預(yù)變性4min；94°C變性45s，在最優(yōu)退火溫度中復(fù)性35s(表1)，72°C延伸30s，35個循環(huán)；72°C終延伸8 min[12]。

1.2.3 微衛(wèi)星文庫構(gòu)建及陽性克隆菌株的菌落PCR檢測

通過磁珠富集法獲得了PCR產(chǎn)物，對其進行純化濃縮，并將Ligation Mix 5 μl、pMD19-T vectors(TaKaRa)1uL, PCR產(chǎn)物4 uL加入到微量離心管中，通過短暫離心使上述混合液匯集到管底，之后將其在16°C低溫水浴連接2h。通過轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選，挑白色菌落取陽性克隆，挑至含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 225rpm 振蕩培養(yǎng)4 h。用接頭引物Oligo A和引物(CT)15進行菌落PCR，PCR反應(yīng)體系如下：

15 μlPCR驗證反應(yīng)體系

PCR擴增程序：在94°C下預(yù)變性3min；94°C變性35s，60°C退火35s，72°C延伸1min；共30個循環(huán)；72°C延伸10min[12]。檢測得到具有兩條或三條含微衛(wèi)星片段的陽性克隆。

1.2.4 多態(tài)性微衛(wèi)星位點的篩選與數(shù)據(jù)分析

對55個陽性克隆進行了測序，其中包含了大量二核苷酸和三核苷酸的重復(fù)序列，使用PREMIER 5.0軟件為包含重復(fù)序列(26 bp ≤ 重復(fù)序列≤ 65 bp)的基因位點設(shè)計四十五對引物，對3個玉竹自然種群的40個個體的等位基因多態(tài)性進行篩選能穩(wěn)定擴增的引物(表2)。用摸索好最適擴增條件的引物對3個玉竹自然種群的40個樣品進行擴增，從中篩選出可穩(wěn)定擴增的引物。利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對PCR擴增后的產(chǎn)物進行檢測,然后使用變性劑在95℃變性8 min，然后再進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測，對電泳條帶進行分析，利用遺傳數(shù)據(jù)分析[13]計算HE和Ho，并測試是否偏離位點間的連鎖不平衡以及哈溫平衡。利用CERVUS 3.0軟件[14]測定多態(tài)性信息和等位基因數(shù)量(表2)。表1列出了新開發(fā)的微衛(wèi)星位點的詳細(xì)信息。

2 結(jié)果和分析

表1列出了新開發(fā)的微衛(wèi)星位點的詳細(xì)信息。獲得了9個多態(tài)位點，其中5個位點具有多態(tài)性，每個微衛(wèi)星位點的Na數(shù)目從3到6個不等，其平均數(shù)為4.2。這些微衛(wèi)星位點的H0范圍為0000～0.875；HE范圍為0.520～0.760。哈迪-溫伯格平衡檢測表明，5個多態(tài)位點均符合哈迪-溫伯格平衡，位點Pc4,Pc5,Pc6 和Pc7顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05)，這可能是擴增過程中出現(xiàn)了無效等位基因。在12個位點中進行兩兩比較(Po2-Po3,Po1-Po5,Po2-Po5,Po3-Po5,Po2-Po7,Po5-Po7,Po5-Po8,Po7-Po8,Po1-Po9,Po3-Po9,Po5-Po9,Po7-Po9)表現(xiàn)出顯著的位點間的連鎖不平衡。本實驗的樣本容量較小是偏離連鎖不平衡和哈迪-溫伯格平衡的原因之一。偏離哈迪-溫伯格平衡的原因也可能是地理上的限制。在當(dāng)前研究中4個位點偏離的一個重要原因是人口數(shù)量。野生環(huán)境中遺傳多樣性的減少很可能是由于人類活動的影響。長期以來人類活動的影響可能導(dǎo)致了本研究中所篩選的等位基因多樣性較低。但開發(fā)的這些多態(tài)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記可以用來評估玉竹和其他相關(guān)物種的遺傳變異。此外，這些標(biāo)記物可以作為未來標(biāo)記輔助育種的微衛(wèi)星的潛在來源。

表1 從玉竹中獲得的9對多態(tài)性微衛(wèi)星位點的特征

* 表示明顯偏離Hardy-Weinberg平衡(P< 0.05).Ta為最佳退火溫度

表2 由玉竹微衛(wèi)星標(biāo)記獲得的種群參數(shù)

N：樣本量; Na: 等位基因數(shù); HO：觀察雜合度HE：預(yù)期雜合度; PIC：多態(tài)信息含量

3 討 論

本研究通過構(gòu)建微衛(wèi)星文庫，采用磁珠富集法開發(fā)玉竹微衛(wèi)星，成功得到了多態(tài)微衛(wèi)星并應(yīng)用于玉竹不同種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析中。傳統(tǒng)方法直接從基因組文庫中篩選微衛(wèi)星位點，費時間，效率低。磁珠富集法是一種快速、高效的構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫的方法，近年來，磁珠富集法被廣泛應(yīng)用于動植物的微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)研究中[9～11]。

在實驗過程中，采用實驗室往屆彭艷秋等人的方法[15]，陽性克隆率可達(dá)30-40%。一些關(guān)鍵步驟在磁珠富集的過程中值得討論。首先，獲取高質(zhì)量的玉竹基因組DNA是整個實驗的關(guān)鍵步驟。高質(zhì)量的基因組DNA是后續(xù)步驟的有利保證，如文庫構(gòu)建和引物篩選。其次，接頭與酶切后基因組DNA片段連接效率的高低也影響了實驗的順利進行，連接效率可以通過連接后PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳照片來判斷。最后，磁珠富集是過程中最為關(guān)鍵的一步。雜交后的洗脫條件對磁珠富集來說是重要的影響因素，其中洗脫條件包括洗脫溫度以及洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)度。如果洗脫溫度高，SSC濃度低，洗脫過程動作過于劇烈，這樣會導(dǎo)致很多含有微衛(wèi)星的片段丟失；如果洗脫條件不夠嚴(yán)謹(jǐn)，就可能會產(chǎn)生非特異性片段，使文庫中產(chǎn)生假陽性克隆，因此，根據(jù)磁珠的使用說明，并調(diào)整實驗中的若干洗脫條件才能達(dá)到最佳的富集效果。

4 結(jié) 語

本實驗中，觀察雜合度高于預(yù)期雜合度，說明該玉竹居群遺傳多樣性較好。一般通過哈溫平衡定律來衡量群體遺傳結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定。本研究利用9對微衛(wèi)星引物對安徽滁州瑯琊區(qū)玉竹居群進行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)其中4個位點偏離Hardy-Weinberg平衡常數(shù)(p<0.05)。這一結(jié)果造成的主要原因可能是：

(1) 位點間的連鎖反應(yīng)以及非等位基因之間遺傳共適應(yīng)的差異?；蜻B鎖是指位于同一染色體上的不同位點的非等位基因之間的非隨機組合效應(yīng)。如果位點之間出現(xiàn)連鎖反應(yīng)，會造成非等位基因之間的連鎖不平衡現(xiàn)象，最終形成的配子的概率會出現(xiàn)偏離哈溫平衡的現(xiàn)象[16]。在自然群體中，連鎖不平衡現(xiàn)象會出現(xiàn)在中性位點；而在隨機交配群體中，連鎖不平衡現(xiàn)象不強烈[17]，本實驗中連鎖不平衡分析表明有12對位點出現(xiàn)了連鎖不平衡，分別是(Po2-Po3,Po1-Po5,Po2-Po5,Po3-Po5,Po2-Po7,Po5-Po7,Po5-Po8,Po7-Po8,Po1-Po9,Po3-Po9,Po5-Po9,Po7-Po9)(p<0.05)，在一定程度上可能也導(dǎo)致哈溫平衡偏離現(xiàn)象。

(2) 樣本數(shù)量地域較小。增大玉竹采集的地域和數(shù)量，比如擴大到整個安徽的玉竹居群，甚至全國范圍內(nèi)的玉竹可能會增大位點等位基因的數(shù)量。

(3) 群體本身處于日益瀕危狀態(tài)與近親繁殖。玉竹作為中藥材需求量巨大，野生玉竹無法滿足市場的需求，而且近年來滁州經(jīng)濟的開發(fā)對玉竹的生境影響較大。同時，當(dāng)玉竹面臨環(huán)境脅迫時候，會采用無性繁殖的方式，這對物種的基因交流產(chǎn)生不利影響。

(4) 無效等位基因的出現(xiàn)。通過軟件Micro-Checker的分析發(fā)現(xiàn)，偏離哈溫平衡常數(shù)的4個位點中都有無效等位基因的出現(xiàn)。因此，我們認(rèn)為導(dǎo)致上述情況發(fā)生的主要原因可能是位點間連鎖不平衡以及無效等位基因的存在。采集不同地域之間的玉竹，擴大樣本數(shù)量，將可能有助于進一步分析遺傳結(jié)構(gòu)。

近年來，野生中藥植物資源的生境急劇惡化，種質(zhì)多樣性下降，運用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對中藥資源進行研究、創(chuàng)新及再生，以科技為先導(dǎo)，通過諸如中藥分子標(biāo)識育種、組織細(xì)胞培養(yǎng)、藥用植物基因和基因工程等方法，實現(xiàn)中藥資源的長期可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，對促進經(jīng)濟發(fā)展和中藥資源利用與保護具有重大而又深遠(yuǎn)的意義。