宋利華 丁慧 劉杰 白楊 杜玉茗

(1吉林省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，吉林 長(zhǎng)春 130021；青島市第三人民醫(yī)院 2內(nèi)分泌科；3心內(nèi)科；4吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院心臟外科)

糖尿病心肌病(DCM)的特征包括心肌纖維化、炎癥、細(xì)胞凋亡和心室重構(gòu)〔1〕。 糖尿病通過(guò)包括代謝紊亂在內(nèi)等多種途徑影響心臟〔2～4〕。心肌細(xì)胞凋亡的增加與DCM發(fā)展有關(guān)〔5,6〕。有研究表明〔7〕，利格列汀可降低主要心臟不良事件發(fā)生率，可能有獨(dú)立于降糖作用之外的心血管保護(hù)作用，但其機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在觀察利格列汀對(duì)糖尿病心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討其對(duì)糖尿病心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠36只，體重(200±10)g〔購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證SCXK(遼)2015-0001〕，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)(SPF)動(dòng)物房。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 利格列汀片(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司,注冊(cè)證號(hào)：H20130890)，鏈脲佐菌素(STZ,Solarbio公司，貨號(hào)S8050)，羧甲基纖維素鈉(Sigma公司，貨號(hào)9004-67-5)。

1.3主要試劑 Wanleibio公司提供的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡試劑盒(WLA029),全蛋白提取試劑盒(WLA019)，Bcl-2(WL01556)，Bax(WL01637)，酶切caspase-3(WL01992)等。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備及分組 簡(jiǎn)單隨機(jī)的方法分別選取正常對(duì)照組(A組，8只)和利格列汀對(duì)照組(B組，8只)，持續(xù)普通飼料喂養(yǎng)。其余大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)(20%蔗糖、10%豬油、2%膽固醇、1%膽酸鈉、67%基礎(chǔ)飼料)。4 w后，A、B組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，剩余的20只大鼠禁食24 h，腹腔單次注射小劑量35 mg/kg STZ,并于3 d后尾靜脈取血測(cè)血糖濃度，血糖濃度≥16.7 mmol/L確定為建模成功。

1.5給藥方法 造模成功后，喂養(yǎng)至6 w，將存活的17只糖尿病大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病組(C組，8只)和糖尿病/利格列汀組(D組，9只)。大鼠均等體積1 %羧甲基維素鈉溶液灌胃；另外，B和D組3 mg/(kg·d)利格列汀灌胃；持續(xù)4 w。

1.6血糖測(cè)量 造模時(shí)、治療1和4 w末尾靜脈采血測(cè)隨機(jī)血糖，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定。

1.7TUNEL法染色 大鼠心肌組織石蠟包埋切片、脫蠟至水、組織透化、過(guò)氧化氫封閉、孵育、酶標(biāo)記、過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染、封片、鏡檢顯微鏡下觀察染色效果，400×鏡下拍照。細(xì)胞發(fā)生凋亡經(jīng)TUNEL檢測(cè)顯色后呈現(xiàn)細(xì)胞核棕黃色-棕褐色，即凋亡細(xì)胞，用凋亡率來(lái)量化。

1.8Western印跡檢測(cè) 心肌組織裂解勻漿后二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白含量：蛋白質(zhì)抽提、蛋白質(zhì)定量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、電化學(xué)底物發(fā)光、圖像保存。掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析光密度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析和LSD檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1血糖比較 同一時(shí)期比較，C、D組血糖明顯高于A、B組(P<0.05)；治療1 w時(shí)，C組與D組血糖無(wú)變化(P>0.05)；治療4 w時(shí)D組血糖明顯低于C組(P<0.05)。與治療1 w比較，治療4 w A與B組無(wú)明顯變化(P>0.05)；C組血糖顯著升高(P<0.05)，D組血糖顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組治療1、4 w血糖水平的比較

與A、B組比較：1)P<0.05；與C組比較：2)P<0.05；表2同

2.2心肌組織TUNEL凋亡染色 與治療1 w比較，治療4 w A組凋亡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，B、C、D組凋亡顯著增加(P<0.05)。與A、B組比較，C組和D組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增多(P<0.05)；D組心肌細(xì)胞凋亡程度顯著低于C組(P<0.05)。見(jiàn)圖1及表2。

圖1 各組治療不同時(shí)間心肌組織TUNEL凋亡染色結(jié)果(×400)

表2 各組凋亡1、4 w心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.3各組心肌組織中caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 與治療1 w比較，4 w 4組心肌細(xì)胞的caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降；A和B組Bax蛋白表達(dá)下降，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，C與D組Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；說(shuō)明隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡蛋白表達(dá)增加，抗凋亡的蛋白表達(dá)下降。

4 w時(shí)，與A、B組比較，C組caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與C組比較，D組caspase-3、Bax蛋白水平明顯下降(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明利格列汀治療后凋亡蛋白表達(dá)下降，抗凋亡蛋白表達(dá)增加。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 各組治療1、4 w心肌組織中caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

表3 各組治療1、4 w心肌細(xì)胞caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)比較

與A、B組比較：1)P<0.05；與C組比較:2)P<0.05；與治療1 w比較：3)P<0.05

3 討 論

糖尿病發(fā)展和進(jìn)展導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，影響人體大多數(shù)主要器官的功能〔8〕。DCM是Asbun等〔9〕首次提出的糖尿病心臟并發(fā)癥之一。早期研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡和壞死發(fā)生在DCM中，并在DCM的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用〔10,11〕。有研究表明，細(xì)胞凋亡是DCM重要的病理特征〔12〕，本研究中檢測(cè)到糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，這與國(guó)外報(bào)道相一致〔13〕。糖尿病并發(fā)癥現(xiàn)在被認(rèn)為是許多國(guó)家糖尿病人群死亡的主要原因之一〔14,15〕。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡無(wú)疑是防治DCM，降低糖尿病患者死亡率的重要手段。高糖導(dǎo)致線粒體受損，引起心肌細(xì)胞凋亡〔16〕。細(xì)胞凋亡通常是由于線粒體滲透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，caspase-3 被激活引起〔17〕。大量結(jié)果表明，Bcl-2 和Bax 在凋亡通路中有重要作用〔18〕，Bcl-2 和Bax 基因在凋亡過(guò)程中是功能對(duì)立的重要調(diào)控基因，caspase-3 是凋亡過(guò)程中重要的執(zhí)行蛋白酶，Bcl-2、Bax 通過(guò)調(diào)控caspase-3 活性而發(fā)揮抗凋亡作用〔19〕。Bcl-2 作為抗凋亡因子，其同源二聚體可以維持線粒體的穩(wěn)態(tài)，而且Bax 同源二聚體可以直接激活caspase-3〔16〕?；罨腸aspase-3可通過(guò)催化細(xì)胞基質(zhì)裂解，加速細(xì)胞程序性凋亡〔20〕。

本研究表明，利格列汀可能通過(guò)對(duì)凋亡蛋白的調(diào)節(jié)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，但由于作用機(jī)制復(fù)雜，本研究只是從經(jīng)典的凋亡蛋白途徑進(jìn)行分析，可能還存在其他信號(hào)通路或細(xì)胞因子參與心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，有待進(jìn)一步研究，但其仍為防治DCM發(fā)生、發(fā)展提供了新思路和治療靶點(diǎn)。