吳垚群，陳少康，盛熙暉，齊曉龍，王相國，倪和民，郭勇，王楚端，邢凱

（1 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；3 北京市畜牧總站，北京 100101）

0 引言

【研究意義】 長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄長度大于200nt 的非編碼RNAs。目前許多研究已證實(shí)，lncRNA 參與了廣泛的基因表達(dá)的調(diào)控過程，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，已經(jīng)有眾多的lncRNA 在肌肉發(fā)育和脂肪沉積中的作用被發(fā)現(xiàn)[3-5]。由此可見lncRNA是基因表達(dá)調(diào)控的重要因素,本研究的意義在于通過對不同品種豬背最長肌組織中l(wèi)ncRNA 的研究，進(jìn)一步解析豬骨骼肌生長發(fā)育和脂肪沉積的分子機(jī)理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】骨骼肌占哺乳動(dòng)物總體重的50%左右[6]。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs 在骨骼肌發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。在小鼠成肌細(xì)胞中，一個(gè)lncRNA 位于發(fā)育多能性相關(guān)2（developmental pluripotency associated 2, Dppa2）基因上游，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以招募多種DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶到Dppa2 基因的啟動(dòng)子區(qū)域，使Dppa2 基因沉默，進(jìn)而促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化和肌肉再生[7]。lncRNA H19 由H19/胰島素樣生長因子2（insulin like growth factor 2, IGF2）基因座母體等位基因轉(zhuǎn)錄，在胚胎發(fā)育和成年機(jī)體的肌肉組織中表達(dá)較高，H19 通過結(jié)合某些復(fù)合物，起到抑制IGF2 轉(zhuǎn)錄的作用[8]。LU 等人發(fā)現(xiàn) lncRNA YY1 相關(guān)肌發(fā)生 RNA 1（YY1-associated myogenesis RNA 1, Yam-1），受轉(zhuǎn)錄因子YY1（YY1 transcription factor, YY1）的正向調(diào)控，Yam-1 可以激活miR-715、抑制Wnt 家庭成員7B（Wnt family member 7B, Wnt7b）的表達(dá)，可以作為肌細(xì)胞抑制因子發(fā)揮作用[9]。在牛骨骼肌組織中，lncRNA-133a 可以促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖有著正向調(diào)控作用[10]。lncRNA 作為基因表達(dá)的重要調(diào)控分子，可以通過多種作用機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及染色質(zhì)水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控生命活動(dòng)[11]。【本研究切入點(diǎn)】豬骨骼肌的生長發(fā)育與其生長速度和瘦肉率息息相關(guān)，直接關(guān)系著生豬養(yǎng)殖的生產(chǎn)效益。豬肌肉生長發(fā)育的差異是導(dǎo)致不同品種豬肉品質(zhì)差異的重要原因。松遼黑豬是我國培育的第一個(gè)瘦肉型黑色母系品種，是由杜洛克豬、長白豬和東北民豬3 個(gè)品種經(jīng)過長時(shí)間雜交培育而成的一個(gè)培育品種。松遼黑豬具有繁殖率高、肉質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼等特性，同時(shí)松遼黑豬的肌內(nèi)脂肪含量可達(dá)3.19%，豬肉品質(zhì)極佳[12]。長白豬原產(chǎn)于丹麥, 是目前世界上使用最為廣泛的瘦肉型豬種之一，具有生長速度快，瘦肉率高等特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，二者在肉質(zhì)方面存在較大差異[12-13]。因此，以松遼黑豬和長白豬作為試驗(yàn)對象來研究lncRNA 與不同豬品種骨骼肌發(fā)育差異的關(guān)系，有利于研究lncRNA 在豬肌肉發(fā)育過程中的分子機(jī)制。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)lncRNA 在豬肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮作用，但lncRNA 在中外不同品種豬肌肉生長發(fā)育過程中的差異性以及參與的生物學(xué)信息還有待于深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高通量測序技術(shù)對其背最長肌轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，篩選差異表達(dá)的mRNA 和lncRNAs，并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)的分析。最終篩選出關(guān)于豬肌肉發(fā)育和脂肪沉積的關(guān)鍵mRNA 和lncRNAs，以加深對肌肉生長發(fā)育和脂肪沉積分子調(diào)控機(jī)制的了解，為國內(nèi)外豬品種在肉質(zhì)和生長性狀方面形成差異的分子機(jī)理研究提供新的參考信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的長白豬和松遼黑豬來自天津?qū)幒釉N豬場。所有動(dòng)物均在統(tǒng)一條件下飼養(yǎng)管理，自由采食和飲水。飼養(yǎng)至體重為100kg 左右時(shí)進(jìn)行屠宰。屠宰在華都陽光食品公司進(jìn)行。屠宰標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 17236-2008 生豬屠宰操作規(guī)程進(jìn)行[14]。屠宰后，立即將背最長肌組織移至液氮中進(jìn)行冷凍保存，待提取RNA 使用。

1.2 總RNA 提取和建庫

采用Trizol 法按照產(chǎn)品說明提取每個(gè)背最長肌組織的總RNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測總 RNA 的完整性以及有無 DNA 污染。采用Nanodrop、Qubit 2.0 和Aglient 2100 方法檢測各樣品的濃度、純度和完整性等。保證樣品濃度≥500 ng·μL-1，28S:18S ＞1.0，RIN≥8。將每個(gè)品種的6 個(gè)樣品的總RNA 等量混合后，進(jìn)行混池建庫，隨后利用Illumina HiSeq 2500 (Illumina, America)平臺進(jìn)行雙末端測序。文庫的構(gòu)建及測序在廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)的質(zhì)控、比對和組裝

FastQC 軟件（http://www.bioinformatics.babraham. ac.uk/projects/fastqc/）用于對原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)為：（1）去除含adapter 的reads；（2）去除含N 比例大于10% 的reads；（3）去除低質(zhì)量reads （質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read的50%以上）[15]。TopHat2 將高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)（clean reads）比對到豬的參考基因組Sus scrofa 11.1 中[16]。Cufflinks 流程用于數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄本組裝、注釋與合并[17]。HT-seq 軟件用于每個(gè)樣本中基因表達(dá)量的計(jì)算[18]。

1.4 差異表達(dá)基因的功能富集分析

基因本體(gene ontology, GO )數(shù)據(jù)庫 (http://www. geneontology.org/) 被用于差異表達(dá)基因的GO 功能富集分析，包括細(xì)胞組分，分子功能和生物學(xué)過程。超幾何檢驗(yàn)被用于P-value 的計(jì)算其公式為

式中：N 為所有Unigene 中具有GO 注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目；n 為N 中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目；M 為所有Unigene 中注釋為某特定GO 條目的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目；m為注釋為某特定GO 條目的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本數(shù)目。FDR 被用于校正原始的Pvalue。FDR＜0.05 的GO terms 被鑒定為顯著富集的通路。京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 數(shù)據(jù)庫 (https://www.genome.jp/kegg/) 被用于通路研究。同樣，采用上述的方法和閾值鑒定差異表達(dá)基因的顯著富集通路。

1.5 lncRNA 的鑒別

首先，篩選cuffcompare 轉(zhuǎn)錄本類別符號為“I”、“j”、“o”、“u”、“x”的轉(zhuǎn)錄本，其可能是新的lncRNA。進(jìn)一步，為了剔除其中的小的非編碼RNA，過濾掉其中外顯子總長度小于200nt 及只有1個(gè)或無外顯子的轉(zhuǎn)錄本。將剩下的轉(zhuǎn)錄本通過CPAT（Computerized Progressive Attention Training ）軟件[19]進(jìn)行l(wèi)ncRNA 的初步預(yù)測。為了得到可靠的lncRNA，繼而利用CPC（Cetylpyridinium Chloride）軟件[20]對CPAT 軟件預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步lncRNA 的識別。Cufflinks 用于對篩選出來的lncRNA 進(jìn)行定量分析[17]。

1.6 基因及l(fā)ncRNA 的差異表達(dá)分析

采用FPKM（fragments per kb per million fragments）的方法校正基因的表達(dá)水平，其同時(shí)考慮到了測序深度和基因長度對基因計(jì)數(shù)的影響[21]。edgeR 軟件包被用于篩選差異表達(dá)基因[22]，其標(biāo)準(zhǔn)為FDR＜0.05 且|log2FC|＞1。

1.7 差異表達(dá)lncRNAs 的靶基因的預(yù)測

基于lncRNA 的順式作用和反式作用方式預(yù)測差異表達(dá)lncRNA 的靶基因。在lncRNA 基因組位置上下游100kb 的基因認(rèn)為是該lncRNA 潛在的靶基因。利用RNAplex 軟件來預(yù)測lncRNA 通過堿基互補(bǔ)配對的反式作用模式的潛在靶基因[23]。

1.8 測序結(jié)果可靠性分析

為了驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性，對差異表達(dá)的mRNA 和lncRNA 進(jìn)行驗(yàn)證。挑選10 個(gè)差異表達(dá)的mRNA 和10 個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，包括5 個(gè)上調(diào)基因和5 個(gè)下調(diào)基因，進(jìn)行RT-PCR 驗(yàn)證。RT-PCR所使用的cDNA 由高通量測序使用的剩余的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。設(shè)計(jì)所挑選基因的引物，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）基因作為內(nèi)部對照，引物均由上海生工合成（表1）。進(jìn)行RT-PCR，并使用2-ΔΔCt方法計(jì)算樣品之間基因的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量及比對信息

本研究通過Illumina HiSeqTM 2000 測序平臺對松遼黑豬和長白豬的背最長肌組織mRNA 進(jìn)行測序，每個(gè)樣本平均得到約10G 數(shù)據(jù)量。測序數(shù)據(jù)的Q20在96%以上，Q30 在91%以上，測序質(zhì)量良好。對原始數(shù)據(jù)質(zhì)控后，平均每個(gè)樣本得到18 224 475 795 條150bp 的clean reads（表2）。除去比對到核糖體RNA上的reads 后，平均81.22% 的clean reads 比對到豬的參考基因組中，其中唯一比對到基因組位置的為79.49%。各項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好，可以進(jìn)行后續(xù)的分析。

2.2 基因表達(dá)水平和差異分析

對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，松遼黑豬和長白豬得到的所有轉(zhuǎn)錄本數(shù)目分別是21 866 個(gè)和21 972 個(gè)，其中檢測到新的轉(zhuǎn)錄本分別有7 846 個(gè)和7 838 個(gè)。對轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)轉(zhuǎn)錄本的RPKM值在1 000以下，其中FPKM 值在1 以下轉(zhuǎn)錄本最多，為11 047個(gè)；FPKM 值1—10 之間的轉(zhuǎn)錄本為9 905 個(gè)；FPKM值在10—100 的轉(zhuǎn)錄本為2 915 個(gè)；而FPKM 值大于100 的轉(zhuǎn)錄本只有363 個(gè)，占總數(shù)的1.65%。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度模式基本相同（圖1）。

利用edgeR 軟件包來篩選差異表達(dá)基因，顯著差異表達(dá)的條件為 FDR＜0.05 且| log2FC|＞1 。結(jié)果顯示兩組之間一共有4 239 個(gè)基因顯著差異，相對于長白豬，松遼黑豬組中2 023 個(gè)顯著上調(diào)，2 216 個(gè)顯著下調(diào)（圖2）。

2.3 差異表達(dá)基因功能分析

為了解差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)功能，使用超幾何檢驗(yàn)的方法對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 條目和KEGG 通路的功能富集分析。富集GO 條目的結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要分布在生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成的三大類中的3 780 個(gè)GO 條目中，其中 1 314 個(gè)是顯著富集的（Q-value≥0.05）。主要參與的 細(xì)胞膜的組成、跨膜運(yùn)輸、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、能量代謝和氧化磷酸化等過程（表3）。對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路功能富集分析，共鑒定出25個(gè)顯著的通路，其中包括生物素代謝、泛酸鹽輔酶A生物合成、多聚糖生成、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、肌動(dòng)蛋白調(diào)控、溶酶體等通路（圖3）。

表2 質(zhì)控前后樣本測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量Table 2 Quality of sample sequencing data before and after QC

2.4 新lncRNA 的鑒定及差異表達(dá)分析

通過cufflinks、CPAT 和CPC 流程鑒定轉(zhuǎn)錄本 中的lncRNA，共得到885 個(gè)新的lncRNA。所鑒定出的新lncRNA 中，在兩個(gè)組中都有表達(dá)的lncRNA有792 個(gè)，只在松遼黑豬和長白豬中表達(dá)的基因分別為49 個(gè)和44 個(gè) (圖4-A)。同樣利用edgeR分析軟件篩選差異表達(dá)分析，結(jié)果顯示松遼黑豬和長白豬之間一共有178 個(gè)非編碼基因顯著差異，其中在松遼黑豬中84 個(gè)顯著上調(diào)，94 個(gè)顯著下調(diào)（圖4-B）。

圖2 基因的差異表達(dá)分析Fig. 2 Results of differential expression analysis of genes.

表3 差異表達(dá)基因最顯著富集的GO 條目Table 3 GO entries with the most significant enrichment of differentially expressed genes

2.5 lncRNA 的靶基因預(yù)測

基于lncRNA 的作用模式，通過cis 作用和反義作用預(yù)測差異表達(dá)lncRNA 的靶基因。根據(jù)lncRNA 的在染色體上的位置，共在241 個(gè)新預(yù)測到的lncRNA 的上下游500kb 內(nèi)找到342 個(gè)編碼基因。同時(shí)，在26 個(gè)已知的lncRNA 中發(fā)現(xiàn)81 個(gè)編碼基因。使用RNAplex軟件預(yù)測lncRNA 的反義作用靶基因，共鑒定得到84個(gè)lncRNA 與編碼基因存在堿基的互補(bǔ)配對的關(guān)系。

結(jié)合兩組間差異表達(dá)分析和靶基因預(yù)測的結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，幾對差異表達(dá)lncRNA 和基因之間可能存在著潛在的調(diào)控關(guān)系。如新lncRNA TCONS_00041713 和TCONS_00041712 在 ZNF7 基因的上游；lncRNA ENSSSCT00000034982在ERNBP基因的下游且與HCFC1存在堿基互補(bǔ)配對的關(guān)系；新lncRNA TCONS_00024150分別與FGFR1 和 ENSSSCT00000034063 基因間存在堿基互補(bǔ)配對的關(guān)系（圖5）。以上的這些潛在調(diào)控關(guān)系為研究lncRNA 調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而影響肉質(zhì)品質(zhì)提供新的素材。

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG 通路功能富集分析結(jié)果Fig. 3 Functional enrichment analysis of KEGG pathways of differentially expressed genes

圖4 lncRNA 的差異表達(dá)分析Fig. 4 Differential expression analysis results of lncRNA

2.6 測序結(jié)果的驗(yàn)證

通過RT-PCR對隨機(jī)挑選的10個(gè)差異表達(dá)mRNA和10 個(gè)差異表達(dá)lncRNA 進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，隨機(jī)挑選的10 個(gè)mRNA 的RT-PCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表達(dá)趨勢相似（圖6-A），同樣隨機(jī)挑選的lncRNA的驗(yàn)證結(jié)果也與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表達(dá)趨勢相似（圖6-B），證實(shí)了松遼黑豬和長白豬背最長肌組織轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果具有可靠性，可以用于后續(xù)的深入研究。

圖5 lncRNA 和基因之間存在的潛在調(diào)控關(guān)系Fig. 5 Potential regulatory relationships between lncRNA and genes

圖6 差異表達(dá)基因的RT-PCR 驗(yàn)證Fig. 6 RT-PCR verification of differentially expressed genes

3 討論

本研究選用在肌肉品質(zhì)和育肥期期間日增重方面存在較大差異的松遼黑豬和長白豬為對象，對其背最長肌進(jìn)行RNA-seq 測序，篩選與肌肉生長和脂肪沉積相關(guān)的基因。結(jié)合生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)了一些與松遼黑豬和長白豬背最長肌肌肉發(fā)育和脂肪沉積可能相關(guān)的mRNA 和lncRNA。

豬的脂肪性狀直接影響豬肉品質(zhì)，如肌間脂肪含量、胴體瘦肉率等。豬脂肪組織的沉積能力具有品種差異，且不同品種的豬脂肪沉積能力具有較大差異[24]。本研究中，通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)了一些與脂類代謝差異性顯著的信號通路和代謝途徑，如磷脂酰肌醇信號通路、鞘脂信號通路、甘油磷脂代謝途徑、醛固酮的合成與分泌，與之相關(guān)的基因包括二?；视图っ甫?diacylglycerol kinase α, DGKα)、磷脂酰肌醇-4-激酶α(phosphatidylinositol 4-kinase α, PI4Kα)、磷脂酰肌醇5-磷酸 4 激酶 2α(phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase type 2 α, PIP4K2α)、磷脂酶D1(phospholipase D1, PLD1)、脂肪酶F(lipase F, LIPE)、二?；视椭甫?diacylglycerol lipase α, DAGLα)、蛋白激酶D2(protein kinase D2, PRKD2)、脂質(zhì) 1(lipin 1, LPIN1)、3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶4(glycerol-3-phosphate acyltransferase 4, GPAT4)。在篩選得到的差異表達(dá)基因中，發(fā)現(xiàn)一些基因同時(shí)參與不同信號通路和代謝途徑，如DGKα，其在磷脂酰肌醇信號通路和甘油磷脂代謝中均有參與。DGKα 屬于二酰基甘油激酶家族，該酶類家族成員眾多，主要作用為將1,2-二?；视蜕闪字帷GKα 是一種在含有特殊脂類和蛋白質(zhì)分子的外泌體生成的過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的因子，其在脂類代謝活動(dòng)中具有重要作用[25]。前人研究發(fā)現(xiàn)，DGKα 作為LIPF 的下游分子，而LIPF 與食物中的甘油三酯在胃腸道中的消化過程相關(guān)[25]。因此可將DGKα 基因作為影響豬脂類代謝活動(dòng)重要候選基因之一。HE 等研究發(fā)現(xiàn)在豬中LPIN1 基因與肌內(nèi)脂肪沉積及肌肉品質(zhì)存在顯著相關(guān)性，可影響肌內(nèi)脂肪含量、瘦肉率和風(fēng)味，故將LPIN1 基因作為改善肌肉品質(zhì)的候選基因之一[26]。這些基因現(xiàn)在已知的功能均與能量代謝和氧化磷酸化相關(guān)，但是在豬中影響組織脂類代謝的機(jī)制還有待深入研究。

育肥期期間日增重是豬的一種重要的經(jīng)濟(jì)性狀，其受到肌肉發(fā)育直接影響。本研究發(fā)現(xiàn)了一些在松遼黑豬和長白豬之間顯著差異的信號通路和代謝途徑與肌肉發(fā)育有關(guān)，可能是影響育肥期期間日增重差異的因素。這些信號通路和代謝途徑包括肌動(dòng)蛋白調(diào)控過程、磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（phosphoinositide-3-kinase/serine-threonine kinase, PI3K- AKt）信號通路、單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP- activated protein kinase, AMPK）信號通路，參與這些生物過程的基因包括成纖維因子1（fibroblast growth factor 1, FGF1）、成纖維因子10（fibroblast growth factor 10, FGF10）、成纖維細(xì)胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1, FGFR1）、肌醇多磷酸-1-磷酸酶（inositol polyphosphate-1-phosphatase, INPP1）、磷脂酰肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1, PIK3R1）、血管生成素2（angiopoietin 2, ANGPT2）。研究已經(jīng)證實(shí)，F(xiàn)GF1 在細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用[27]；FGF10 在多種細(xì)胞的增殖、遷移、分化和生存中起到重要的支持作用[28]。PIK3R1 基因可編碼磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide-3-kinase, PIK3）的調(diào)節(jié)亞基p85α蛋白[29-30]，而PIK3 作用于多種細(xì)胞外因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡等多種生命活動(dòng)中起到重要作用[31]?？砂l(fā)現(xiàn)這些基因多數(shù)與細(xì)胞增殖、生長和分化等生命活動(dòng)相關(guān)。在功能方面，多數(shù)與腫瘤細(xì)胞相關(guān)，但與肌肉細(xì)胞增殖生長的相關(guān)報(bào)道很少。因此，這些基因可作為研究肌肉發(fā)育的候選 基因進(jìn)行深入研究和驗(yàn)證。

在生物學(xué)功能分析中，本研究發(fā)現(xiàn)生物素代謝過程最為顯著。生物素，又稱為維生素H、輔酶R，是一種在機(jī)體內(nèi)生物活動(dòng)過程中必不可少的輔酶因子[32]。GO 功能分析發(fā)現(xiàn)全羧化酶合成酶（holocarboxylase synthetase, HLCS）和生物素酶（biotinidase, BTD）基因參與了生物素代謝過程。HLCS 作用是能夠催化生物素與羧化酶及組蛋白結(jié)合[33-35]。DO 等在對豬飼料利用效率的研究中發(fā)現(xiàn)該基因與剩余采食量性狀具有顯著關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)全羧化酶合成酶活性喪失時(shí)會(huì)對機(jī)體組織的葡萄糖、脂肪及蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)生重要影響[36]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)HLCS 基因在兩個(gè)品種豬背最長肌組織中表達(dá)顯著差異，提示HLCS 可能參與了肌肉組織的生物代謝活動(dòng)，與豬生長性狀具有潛在聯(lián)系。BTD缺乏時(shí)會(huì)導(dǎo)致腸道對生物素的攝取能力下降，導(dǎo)致體內(nèi)生物素缺乏，使依賴于生物素的各種羧化酶（丙酰輔酶A 羧化酶、丙酮酰羧化酶、乙酰輔酶A 羧化酶和甲基巴豆酰輔酶A 羧化酶）的活性下降，影響糖類、脂肪及氨基酸代謝活動(dòng)[37]。

在本研究中通過對差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測和功能分析，3 個(gè)差異表達(dá)lncRNA 與基因之間可能存在著潛在的調(diào)控關(guān)系，分別是 TCONS- 00024150、TCONS-00041713、TCONS-00041712。其中新lncRNA TCONS-00041713 和TCONS-00041712位于鋅指蛋白7（zinc finger protein 7, ZNF7）基因的上游。ZNF7 屬于鋅指蛋白家族，前人研究發(fā)現(xiàn)，許多鋅指蛋白家族成員在脂肪生成過程中起到關(guān)鍵的作用[38-39]。同時(shí)，在本研究發(fā)現(xiàn)新lncRNA TCONS- 00024150 與FGFR1 基因間存在堿基互補(bǔ)配對的關(guān)系，F(xiàn)GFR1 在脂肪組織中最先被發(fā)現(xiàn)，其可能在血管新生、糖脂調(diào)節(jié)、新陳代謝等方面發(fā)揮作用[40]。本研究表明新lncRNAs 可能參與了肌肉組織的脂類代謝活動(dòng)，為解釋豬品種間脂肪性狀差異性提供新的思路，可為脂肪性狀相關(guān)的基因研究奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，通過對松遼黑豬和長白豬背最長肌之間差異表達(dá)基因的鑒定與分析，篩選出多個(gè)參與肌肉發(fā)育和脂類代謝的候選基因，其包括HLCS、BTD、DGKα、LPIN1、FGF1、FGF10、FGFR1 和ZNF7 基因。這些基因可能對研究松遼黑豬和長白豬兩品種間肌肉發(fā)育和肌肉脂類代謝的差異性研究具有參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究通過高通量測序技術(shù)對松遼黑豬和長白豬 背最長肌肌肉組織進(jìn)行RNA 測序，通過基因比對分析，篩選出4 239 個(gè)編碼基因差異mRNA，其中2 023個(gè)顯著上調(diào)，2 216 個(gè)顯著下調(diào)；與此同時(shí)，篩選出178 個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，84 個(gè)顯著上調(diào)，94 個(gè)顯著下調(diào)。通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能分析和KEGG 通路分析共篩選出了HLCS、BTD、DGKα、LPIN1、FGF1、FGF10、FGFR1 和ZNF7 等與脂類代謝和肌肉發(fā)育相關(guān)的基因，并且參與了相關(guān)的信號通路和生物代謝途徑。結(jié)合差異表達(dá)基因分析和靶基因預(yù)測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾對差異表達(dá)lncRNA 和mRNA 之間可能存在著潛在的調(diào)控關(guān)系。如新 lncRNA TCONS_00041713 和TCONS_00041712 在ZNF7 基因的上游；lncRNA ENSSSCT00000034982 在ERNBP基因的下游且與HCFC1 存在堿基互補(bǔ)配對的關(guān)系；新 lncRNA TCONS_00024150 分別與 FGFR1 和 ENSSSCT00000034063 基因間存在堿基互補(bǔ)配對的關(guān)系。這些結(jié)果為了解松遼黑豬和長白豬之間肌內(nèi)脂肪含量和肌肉發(fā)育性狀差異的分子機(jī)制提供了新的參考。