孟淑君，張雪海，王琪月，張穩(wěn)，黃力，丁冬，湯繼華

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativaL.）是中國最重要的糧食作物，隨著全球氣候變暖及生態(tài)環(huán)境惡化，水稻生長過程中遭受的干旱、高鹽等非生物脅迫日益增加。鹽脅迫作為主要的非生物脅迫之一，嚴(yán)重影響水稻的生長發(fā)育。植物鹽脅迫一般表現(xiàn)為滲透脅迫和離子毒害2 個(gè)階段，引起植株體內(nèi)活性氧破壞、膜系統(tǒng)損傷、光合和呼吸作用受抑制、酶活性降低等；表現(xiàn)為植株矮小，葉片黃化，最終導(dǎo)致糧食產(chǎn)量、品質(zhì)的下降[1]。在高鹽環(huán)境下，水稻會產(chǎn)生2 種生理反應(yīng)：快速的滲透反應(yīng)，能抑制新梢/根的生長；較慢的離子反應(yīng)，加速成熟葉片的衰老或加快細(xì)胞程序性死亡[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】MicroRNAs（miRNAs）是一類普遍存在于生物體內(nèi)，5'端帶有磷酸基團(tuán)，3'端帶有羥基，長度為20—24 nt 的內(nèi)源性非編碼小分子RNA[3]，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因的表達(dá)。miRNA 通過剪切靶基因轉(zhuǎn)錄本或抑制靶基因翻譯行使其生物學(xué)功能[4-5]。在植物中，miRNA 通過對靶基因的調(diào)控，參與植物的生長發(fā)育、器官形態(tài)建成、生物及非生物脅迫響應(yīng)等多種生物學(xué)進(jìn)程[6-7]。GAO 等[8]發(fā)現(xiàn)miR393 的表達(dá)水平在鹽堿脅迫下明顯上調(diào)，而過表達(dá)miR393 的轉(zhuǎn)基因水稻對鹽堿處理比野生型更敏感，表明miR393 是水稻鹽堿脅迫的負(fù)調(diào)控miRNA。YANG 等[9]研究表明，過表達(dá)miR171c 可降低水稻的鹽脅迫耐受能力，說明miR171c 是水稻耐鹽脅迫的負(fù)調(diào)控因子。此外，miRNA156 是調(diào)控水稻干旱和鹽脅迫的重要因子[10]，水稻miR393可以和miR390 在不同脅迫條件下協(xié)同調(diào)控水稻側(cè)根生長[11]。tRF 是一種最近被發(fā)現(xiàn)的、在動(dòng)植物中廣泛存在的小分子量非編碼RNA，其結(jié)構(gòu)、分布及其生物學(xué)功能正日益受到研究者關(guān)注。tRF 序列全長20—40 nt，由前體tRNA 或成熟tRNA 經(jīng)核苷酸酶加工和修飾而成[12]。tRF 最先在人類細(xì)胞中被鑒定獲得[13]。根據(jù)來源不同，tRF 可被分為3'端tRF[14]、不包含5'端和3'端結(jié)構(gòu)的tRF[15]、含有CCA 結(jié)構(gòu)的tRF[16]、5'端tRF[17]、tRNA 半分子tiR（tRNA-derived stress-induced RNAs）[18]等5 種類型。功能研究表明，tRF 具有類似于miRNA 的調(diào)控功能，是一種潛在的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控因子。tRF 在調(diào)控mRNA 翻譯、細(xì)胞增殖、應(yīng)激條件下細(xì)胞應(yīng)答和人類疾病方面均具有重要作用[19]。除了在四膜蟲中[20]，tRF 的表達(dá)與它們各自的前體tRNA 的豐度無關(guān)[21,17]。迄今為止，tRF在植物中的功能研究相對較少。CHEN 等[22]在水稻胚愈傷組織中鑒定到大量tRF，其中表達(dá)量最高的tRF來自于Ala-AGC tRNA 的5'端，且未分化愈傷中的tRF含量顯著高于已分化愈傷。【本研究切入點(diǎn)】根系是水稻直接接收鹽脅迫信號的部位。除功能基因外，調(diào)控性核酸分子在植物逆境響應(yīng)過程中也發(fā)揮著不可替代的作用。miRNA 是植物脅迫響應(yīng)的上游調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)響應(yīng)脅迫信號。而作為新近發(fā)現(xiàn)的小分子量調(diào)控RNA，tRF 在植物脅迫響應(yīng)方面的鑒定及功能研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以水稻粳稻品種日本晴為試驗(yàn)材料，對鹽脅迫處理的水稻根系材料進(jìn)行了小分子量RNA 測序，并利用qRT-PCR 方法對測序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。鑒定和篩選到水稻鹽脅迫響應(yīng)miRNA、tRF 及其靶基因；分析鹽脅迫處理/非鹽處理水稻根系miRNA、tRF 差異表達(dá)情況，并建立了水稻非編碼小分子量RNA 參與的鹽脅迫響應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

挑選飽滿且均勻一致的水稻粳稻品種日本晴種子60 粒，剝?nèi)シN子的穎殼，在超凈工作臺內(nèi)經(jīng)75%酒精浸泡清洗5 min，用0.1%升汞處理20 min，滅菌去離子水清洗4—5 次，并用濾紙吸取多余的水分。將滅菌處理過的種子分別鋪于1/2MS 和含150 mmol·L-1NaCl的1/2MS 培養(yǎng)基上，每個(gè)直徑90 mm 的培養(yǎng)皿中鋪放30 粒種子。用滅菌的鑷子夾取種子，將水稻種子按照從左到右的順序均勻排列。封口膜封口后的培養(yǎng)皿放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，待種子露白后于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（每日光照28℃ 14 h/黑暗25℃ 10 h）。處理21 d 后，取鹽脅迫處理/非鹽處理水稻植株根部樣品液氮中速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ糠莶牧先? 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別用于提取根系組織總RNA進(jìn)行小分子量RNA 測序，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)由3 個(gè)植株的根系樣品等量混合組成。

1.2 水稻根系RNA 提取

使用冷凍的TriZol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）根據(jù)RNeasy minikit（Qiagen, Hilden, Germany）說明書提取水稻根系總RNA，利用NanoDrop2000 分光光度計(jì)檢測RNA 濃度，并利用Agilent2100 檢測RNA 樣品的質(zhì)量及完整性。

1.3 Small RNA 建庫測序

使用15%PAGE 膠分離不同片段大小的RNA，取14—40 nt 條帶回收小分子量RNA；使用RNA 連接酶將回收的小分子量RNA 加上3'和5'接頭，每次連接后進(jìn)行切膠回收。將最終回收到的小分子量RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR 擴(kuò)增16 個(gè)循環(huán)；用PAGE 膠對PCR 產(chǎn)物切膠回收，完成文庫構(gòu)建，質(zhì)檢后用于高通量測序。利用illumina Nextseq500 儀器，75SE 測序模式對樣品進(jìn)行小分子量RNA 測序。

1.4 Small RNA 數(shù)據(jù)分析方法

首先對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除有5'接頭污染的、長度小于18 nt、polyA 和低質(zhì)量（Q＜=5）的reads，得到clean reads 用于數(shù)據(jù)分析。

1.4.1 miRNA 數(shù)據(jù)分析 利用bowtie 軟件[23]將數(shù)據(jù)與miRBase 數(shù)據(jù)庫（水稻）（http://www.miRBase.org/, Version 21；包括172 個(gè)成熟的miRNA）進(jìn)行比對。當(dāng)測序片段與數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA 序列錯(cuò)配數(shù)小于2 時(shí)認(rèn)為該測序片段為已知的miRNA。為了判斷樣品之間miRNA 的表達(dá)量差異，用featurecounts 軟件[24]統(tǒng)計(jì)樣本reads 數(shù)。用DESeq2 進(jìn)行差異基因分析[23]。將每個(gè)樣品的所有miRNA 進(jìn)行歸一化處理，處理后如果miRNA 在2 個(gè)材料內(nèi)的表達(dá)量都小于1RPM，則不予考慮[25]。兩材料之間表達(dá)量差異大于2 倍（log2FC＞1 或＜-1），則認(rèn)為是差異表達(dá)的小分子量RNA。

1.4.2 tRF 數(shù)據(jù)分析 從Ensembl 數(shù)據(jù)庫（http://grch37. ensembl.org/index.html）下載水稻參考基因組數(shù)據(jù)的注釋信息，從中篩選出tRNA 的注釋信息，將tRNA 序列從反密碼子處分開，區(qū)分為tRNA 的5'和3'端，構(gòu)建tRF 序列比對文件。根據(jù)構(gòu)建的5'和3'的注釋信息，使用featurecounts軟件統(tǒng)計(jì)與tRNA5’及3’序列匹配的reads 數(shù)目，并計(jì)算每種長度的tRF 所占的比例。

1.5 miRNA 和tRF 及其靶基因表達(dá)量分析

分別以日本晴鹽處理/非鹽處理根系總RNA 為模板，利用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis 試劑盒（TaKaRa）加A 法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。利用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）熒光定量試劑盒在 CFX96 Real-Time PCR Detection System 實(shí)時(shí)定量PCR 儀上對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)差異的3個(gè)miRNA 基因（miR156、miR167 和miR396）進(jìn)行定量分析。miRNA 的定量引物使用其成熟序列（U 用T 取代）作為qRT-PCR 的正鏈引物（F）（表1），試劑盒中的mRQ3'作為負(fù)鏈引物（R）。內(nèi)參為U6，qRT-PCR 引物列于表1 中，每個(gè)反應(yīng)設(shè)有3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。采用2–ΔΔCt方法[26]計(jì)算基因的相對表達(dá)量，并利用T 測驗(yàn)分析基因的表達(dá)差異。

選取測序結(jié)果中差異表達(dá)的來源于 tRNA EPlORYSAT000373840 和EPlORYSAT000373812 的2個(gè)tRF，截取特異序列作為正鏈引物（F）（表1）， 進(jìn)行qRT-PCR 分析，方法同miRNA 定量。

靶基因定量分析利用TaKaRa PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa）對總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用Primer3（http://primer3.ut.ee/）在靶基因外顯子區(qū)設(shè)計(jì)特異定量引物（表1），qRT-PCR 方法同上，內(nèi)參基因?yàn)镺sβ-Actin。

表1 水稻鹽脅迫相關(guān)基因qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences of salt stress related genes in rice

1.6 保守性miRNA 及tRF 靶基因分析

利用psRNATarget 網(wǎng)站（https://plantgrn.noble. org/psRNATarget/analysis）預(yù)測保守Small RNA 靶基因及其功能，在Gramene 網(wǎng)站（http://www.gramene. org/）使用BLAST 功能分析tRF 靶基因并進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 水稻鹽脅迫響應(yīng)表型

在1/2MS 培養(yǎng)基中對水稻進(jìn)行鹽脅迫處理21 d， 150 mmol·L-1NaCl 處理與非鹽處理相比，水稻日本晴幼苗明顯受到鹽脅迫的抑制（圖1）。

圖1 NaCl 處理21 d 的水稻苗期表型Fig. 1 Phenotypes of rice seedlings at 21 days under NaCl

2.2 RNA-seq 測序數(shù)據(jù)保守miRNA 的鑒定

2.2.1 水稻小分子量RNA 測序 對日本晴鹽處理和非鹽處理21 d 根系的小分子量RNA 文庫進(jìn)行高通量測序，以鑒定影響水稻鹽脅迫響應(yīng)的miRNA 和tRF。為消除不同個(gè)體間的差異，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于RNA 提取及后續(xù)測序分析。鹽處理和非鹽處理21 d 的水稻根系每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共6 個(gè)樣品，共得到150 501 099 條測序數(shù)據(jù)。平均每個(gè)樣品有25 083 517 個(gè)讀數(shù)，范圍從15 848 571到54 767 011。測序所得的小分子量RNA 幾乎涵蓋所有RNA 類型，包括tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、siRNA、miRNA、外顯子和內(nèi)含子降解片段等。片段大小在18—75 bp，根據(jù)小分子量RNA 的長度獲得分類柱狀圖（圖2）。在鹽處理水稻根系中24 nt 的小分子量RNA 的量最多，占其測序數(shù)據(jù)的18.40%，非鹽處理水稻根系中24 nt 的小分子量RNA 的量占其測序數(shù)據(jù)的16.27%。鹽處理水稻根系中34—38 nt 的小分子量RNA 的量明顯多于非鹽處理水稻根系。

2.2.2 水稻鹽脅迫響應(yīng)miRNA 的鑒定 將測序數(shù)據(jù)與水稻miRNA 數(shù)據(jù)庫miRBase（http://www.mirbase. org）中的成熟序列及前體序列進(jìn)行比對，鑒定出保守的miRNA。以至少有一個(gè)樣品RPM＞1 為篩選條件， 共比對到451 個(gè)miRNA。為了尋找表達(dá)量較高的miRNA，以至少有一個(gè)樣品RPM＞50 為篩選條件，共比對到149 個(gè)miRNA（電子附表1）。

2.2.3 保守miRNA 差異表達(dá)分析 為了尋找水稻鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的差異miRNA，對檢測到的149 個(gè)保守miRNA 進(jìn)行均一化后的差異分析，以至少一組數(shù)據(jù)RPM＞500 為篩選條件，共得到54 個(gè)miRNA，分屬于25 個(gè)miRNA 家族。對在鹽脅迫處理和非鹽處理?xiàng)l件下水稻日本晴根系的miRNA 的表達(dá)量進(jìn)行分析，以log2FC＞1 或＜-1 為篩選條件，共得到8 個(gè)表達(dá)量顯著上調(diào)的miRNA和23個(gè)表達(dá)量顯著下調(diào)的miRNA（表2），屬于12 個(gè)miRNA 家族。

圖2 小分子量RNA 的長度分類柱狀圖Fig. 2 Histogram of the length of small molecular RNA

圖3 檢測到的每個(gè)miRNA 家族成員數(shù)Fig. 3 The number of detected family members per miRNA family

水稻鹽脅迫相關(guān)的miRNA 的差異還反映在每個(gè)家族成員的數(shù)目上（圖3）。測序結(jié)果檢測到數(shù)目最多的miRNA 家族是osa-miR156，由10 個(gè)成員組成；隨后是osa-miR167、osa-miR397、osa-miR396和osa-miR159，分別有7、2、2 和3 個(gè)成員。其他的miRNA 家族，如osa-miR1882、osa-miR1432、osa-miR168、 osa-miR1432、osa-miR1876、osa-miR164 和osa-miR5077等，只檢測到一個(gè)鹽脅迫響應(yīng)成員。說明不同miRNA家族成員對鹽脅迫信號響應(yīng)情況存在差異。

表 2 水稻鹽脅迫響應(yīng)差異表達(dá)miRNATable 2 Differentially expressed miRNAs in response to salt stress in rice

2.2.4 差異miRNA 靶基因預(yù)測 大多數(shù)植物內(nèi)保守 的miRNA 與其靶基因具有高度的匹配，一個(gè)miRNA可以靶定多個(gè)靶基因。利用miRNA 預(yù)測軟件psRNA Target program（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）對在水稻鹽脅迫響應(yīng)的31 個(gè)差異表達(dá)的miRNA（12個(gè)miRNA 家族）的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，共得到162個(gè)靶基因（電子附表2）。

2.2.5 差異miRNA 及其靶基因的qRT-PCR 表達(dá)分析 選擇在本研究中被檢測到的家族成員較多，且在其他物種中已有其與鹽脅迫相關(guān)報(bào)道的3 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，包括miR156、miR167 和miR396，利用qRT-PCR 對其成熟序列進(jìn)行檢測驗(yàn)證，結(jié)果表明，高通量測序與qRT-PCR 雖然存在相對倍數(shù)的差異，但所有檢測miRNA 的相對表達(dá)差異與測序數(shù)據(jù)相一致（表2 和圖4）。這種表達(dá)量差異倍數(shù)差異也許是由于2 種技術(shù)的操作原理與精度不同導(dǎo)致的。利用qRT-PCR 對選擇的miRNA 對應(yīng)的靶基因進(jìn)行表達(dá)量分析。在鹽脅迫條件下，miR156 的靶基因OsSPL11（Os06g45310）和OsSPL13（Os07g32170）的相對表達(dá)量都較對照有顯著降低；miR167 的靶基因Os06g03830相對表達(dá)量顯著上調(diào)，而OsARF6（Os02g0164900）的相對表達(dá)量較對照極顯著下調(diào)；miR396 的靶基因OsGRF2（Os06g10310）的相對表達(dá)量和對照相比極顯著上調(diào)（圖4）。

圖4 水稻鹽脅迫相關(guān)miRNA 及其靶基因的qRT-PCR 表達(dá)分析Fig. 4 qRT-PCR expression analysis of salt stress miRNAs and target genes in rice

2.2.6 水稻鹽脅迫響應(yīng)tRF 的鑒定及靶基因預(yù)測通過與tRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以至少有一個(gè)樣品RPM＞1 為篩選條件[25]，與tRNA 5'端序列共比對到145 個(gè)tRF。與非鹽處理的日本晴相比，在鹽脅迫條件下的日本晴有77 個(gè)差異表達(dá)的tRF，其中有75 個(gè)上調(diào)表達(dá)的tRF，2 個(gè)下調(diào)表達(dá)的tRF（電子附表3），以至少一組數(shù)據(jù)RPM＞50 數(shù)據(jù)為篩選條件，共比對到6 個(gè)tRF，其中有3 個(gè)tRF 的表達(dá)量是上升的，其余3 個(gè)tRF 無差異（表3）。以至少有一個(gè)樣品RPM ＞1 為篩選條件，3'端共比對到78 個(gè)tRF，與非鹽處理的日本晴根系相比，在鹽脅迫條件下的日本晴根系有58 個(gè)上調(diào)表達(dá)的tRF，其余的tRF 無表達(dá)差異（電子附表3），以至少一組數(shù)據(jù)RPM＞50 數(shù)據(jù)為篩選條件，共比對到4 個(gè)tRF，其中3 個(gè)tRF 的表達(dá)量上調(diào)（表3）。與非鹽處理的日本晴根系相比，在鹽脅迫條件下的日本晴根系在 3'和 5'端比對到tRF 共有的來源tRNA 有2 個(gè)，分別為tRNA-Glu的EPlORYSAT000373797以及 tRNA-Asp 的EPlORYSAT000373840。由此可見，大多數(shù)tRF 受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，推測這些差異tRF 可能是水稻鹽脅迫響應(yīng)通路中的重要調(diào)節(jié)因子。

表3 水稻鹽脅迫相關(guān)tRF 的來源tRNATable 3 Source tRNA of tRFs related to salt stress in rice

利用Gramene 網(wǎng)站（http://gramene.org/）的BLAST功能對鹽脅迫誘導(dǎo)的6 個(gè)tRF 進(jìn)行靶基因預(yù)測，共得 到29 個(gè)靶基因（表4）。

2.2.7 鹽脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá) tRF 及其靶基因的qRT-PCR 表達(dá)分析 對水稻鹽脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá)的2 個(gè)tRF（EPlORYSAT000373812和EPlORYSAT000373840）進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，結(jié)果表明，檢測tRF 的相對表達(dá)差異與測序數(shù)據(jù)相一致（圖5），與非鹽處理相 比，鹽處理水稻根系中2 個(gè)tRF 的相對表達(dá)量均顯著升高。利用qRT-PCR 對EPlORYSAT000373812 和EPlORYSAT000373840 靶基因 Os01g0810100、Os04g0531300 的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖5），與非鹽處理相比，鹽處理水稻根系中靶基因的相對表達(dá)量均顯著降低。

表4 水稻鹽脅迫差異表達(dá)tRF 預(yù)測靶基因Table 4 Predictive target genes for differential expression of tRFs in rice salt stress

圖5 水稻鹽脅迫相關(guān)tRF 及其靶基因的qRT-PCR 表達(dá)分析Fig. 5 qRT-PCR expression analysis of salt stress tRFs and target genes in rice

3 討論

3.1 使用RNA-seq 方法，可高通量獲得水稻鹽脅迫響應(yīng)small RNA

已有研究表明，植物遭受非生物脅迫會誘導(dǎo)相應(yīng) miRNA 的表達(dá)變化，通過對其靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控影響植株形態(tài)、生理和代謝以對逆境做出響應(yīng)。RNA-Seq 技術(shù)已經(jīng)成為目前研究脅迫相關(guān)的miRNA功能及調(diào)控路徑的主要方法[27-29]。

水稻是鹽敏感作物，高鹽環(huán)境能夠影響水稻正常的代謝活動(dòng)，引起細(xì)胞壁的破壞、膜系統(tǒng)破壞、細(xì)胞質(zhì)溶解，產(chǎn)生滲透脅迫甚至離子毒害，并影響基因組的穩(wěn)定性，最終引起細(xì)胞凋亡或植株死亡，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。miRNA 在水稻鹽脅迫響應(yīng)通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究通過RNA-Seq 手段共檢測到水稻根系鹽脅迫差異表達(dá)的miRNA 54 個(gè)，分屬于25 個(gè)miRNA 家族，其中8 個(gè)miRNA 表達(dá)量上調(diào)，23 個(gè)miRNA 表達(dá)量下調(diào)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對測序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，miRNA 定量結(jié)果與測序結(jié)果基本一致，說明RNA-Seq能夠高通量、準(zhǔn)確可靠地鑒定鹽脅迫下水稻根系miRNA 的表達(dá)情況。

由于miRNA 的堿基序列較短，靶定的靶基因較多，且參與許多較復(fù)雜的生物學(xué)過程并起很重要的調(diào)控作用，因而預(yù)測miRNA 的靶基因是研究miRNA 作用機(jī)制的基礎(chǔ)，研究miRNA 的功能及作用機(jī)制就要研究靶基因與其miRNA 的相互作用方式。本研究運(yùn)用psRNATarget 網(wǎng)站分析鑒定了RNA-Seq 中篩選得到的鹽脅迫相關(guān)差異表達(dá)的miRNA 靶基因162 個(gè)。這些miRNA 通過對其靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控影響水稻鹽脅迫響應(yīng)的生理生化過程。

3.2 miRNA 在不同植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中功能的通用性

在本研究檢測到的差異表達(dá)基因中，有8 個(gè)miRNA 家族在其他物種中也被報(bào)道為鹽脅迫響應(yīng)miRNAs，如表達(dá)量下調(diào)的osa-miR397、osa-miR396、osa-miR156、osa-miR167、osa-miR1432 和表達(dá)量上調(diào)的osa-miR159、osa-miR168、osa-miR164。研究表明，紅花miR397a表達(dá)可增強(qiáng)植物對NaCl 的敏感性[30]；番茄的miR397過表達(dá)植株中，LeLACmiR397表達(dá)量降低，從而使番茄出現(xiàn)鹽敏感表型[31]。煙草中Sp-miR396a-5p 通過作用于NtGRF1和NtGRF3的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，靶向NtGRF7調(diào)控滲透應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)和病原菌感染，在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[32]。紫花苜蓿在重度鹽脅迫下，miR156 下調(diào)了SPL 轉(zhuǎn)錄因子家族基因，修飾了重要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并下調(diào)下游鹽脅迫應(yīng)答基因，說明miR156 在紫花苜蓿對鹽脅迫的生理反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄過程中起著調(diào)節(jié)作用[33]。在番茄中鹽、干旱和熱處理導(dǎo)致了miR167 表達(dá)量下調(diào)，表明不同脅迫激活了miR167a調(diào)控替代機(jī)制[34]；擬南芥中miR167 與其靶基因ARF6和ARF8之間存在反饋調(diào)節(jié)作用，ARF6激活miR167表達(dá)，ARF8抑制miR167 表達(dá)，它們之間的彼此激活或抑制作用調(diào)控不定根的形成[35]。毛竹經(jīng)強(qiáng)光、黑暗、高溫、低溫、NaCl 等脅迫處理后，葉片中phe-miR1432的表達(dá)下調(diào)[36]。YIN 等[37]利用棉花耐鹽品種和鹽敏感品種研究miRNA 的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，鹽敏感品種中的miR159 表達(dá)下調(diào)；而在耐鹽品種中miR156a/d/e、miR169 顯著下調(diào)，miR167a、miR397a/b上調(diào)。miR168 介導(dǎo)的反饋調(diào)控環(huán)調(diào)節(jié)ARGONAUTE1（AGO1）的穩(wěn)態(tài)對基因表達(dá)調(diào)控和植物發(fā)育至關(guān)重要，過表達(dá)miR168a 的植株和AGO1功能缺失突變體均表現(xiàn)出ABA 超敏性和耐旱性，而mir168a突變體表現(xiàn)出ABA 低敏性和干旱超敏性[38]；高鹽條件下擬南芥中miR168 的表達(dá)量在初期上升，但6 h 后恢復(fù)正常水平[39]。李賀春等[40]利用miRNA 基因芯片雜交技術(shù)對鹽脅迫條件下耐鹽棉花品系和鹽敏感棉花品種的miRNA 進(jìn)行差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下miR156、miR164、miR167、miR397 和miR399 在耐鹽棉花品系較鹽敏感品系表達(dá)上調(diào)。以上分析表明，部分水稻中的鹽脅迫響應(yīng)miRNA 在其他植物的鹽脅迫信號通路中依然適用，說明了這些miRNA 在調(diào)節(jié)不同植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中功能的通用性及進(jìn)化的整體性。

在miRNA 與下游靶基因的對應(yīng)關(guān)系中，某一miRNA 可能有不止一個(gè)靶基因，這些靶基因可能含有類似結(jié)構(gòu)域，也可能隸屬不同家族的蛋白，涉及植株不同的發(fā)育進(jìn)程和調(diào)控路徑。如本研究中的miR156 參與了水稻鹽脅迫響應(yīng)過程，其靶基因有OsSPL11和OsSPL12，說明miRNA 與其靶基因共同參與的植物逆境應(yīng)答是一個(gè)極其復(fù)雜多變的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3.3 tRF 在水稻鹽脅迫條件下差異表達(dá)

tRF 作為新近發(fā)現(xiàn)的含量豐富的非編碼小分子調(diào)控性RNA，日益受到研究者的關(guān)注。盡管tRF 已被證明在生物細(xì)胞中普遍存在，其產(chǎn)生機(jī)制、結(jié)構(gòu)、分布、生物學(xué)功能和作用機(jī)制等方面的研究仍處于起步階段。已有研究表明，tRF 可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[41-43]、應(yīng)激條件下的細(xì)胞應(yīng)答[44-46]、惡性腫瘤[47-48]等人類疾病，但目前植物中tRF 的研究鮮有報(bào)道。本研究通過RNA-Seq 技術(shù)手段，在全基因組層面挖掘了水稻鹽脅迫響應(yīng)tRF。鹽脅迫處理后，水稻根系產(chǎn)生的34—38nt tRF 顯著多于未處理材料，說明tRF 的產(chǎn)生并非是隨機(jī)的，而是通過某種特定機(jī)制或特定信號誘發(fā)tRNA 的加工[41,17]。與對照組相比，共檢測到鹽脅迫響應(yīng)的6 個(gè)表達(dá)量很高且由鹽脅迫誘導(dǎo)的tRF，而未檢測到表達(dá)量下調(diào)的tRF。推測這些差異tRF 是潛在的水稻鹽脅迫響應(yīng)tRF。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR手段證實(shí)了它們的存在和驗(yàn)證了測序結(jié)果的可靠性。進(jìn)一步證明tRF 可能受到鹽脅迫誘導(dǎo)，tRNA 加工增強(qiáng)，導(dǎo)致tRF 表達(dá)量上升。

靶基因分析發(fā)現(xiàn)，這些tRF 的靶基因?yàn)槿~綠體核糖核酸酶Ⅲ域蛋白、F-box 和DUF 結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、LMBR1 膜內(nèi)蛋白、內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體及玉米素葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等，表明其參與了水稻不同的調(diào)控路徑，也說明了tRF 在水稻鹽脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的功能重要性。而不同結(jié)構(gòu)的tRF 與其靶基因之間的對應(yīng)關(guān)系，tRF 表達(dá)量與其靶基因表達(dá)量之間的對應(yīng)關(guān)系有待進(jìn)一步的研究。

根據(jù)以上的研究結(jié)果，構(gòu)建了依賴miRNA 和tRF的水稻鹽脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6）。

4 結(jié)論

水稻中大多數(shù)tRF 受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；共檢測到12 種水稻根系中鹽脅迫響應(yīng)miRNA，其靶基因多為轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，推測其通過對其靶基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與了鹽脅迫響應(yīng)的表達(dá)調(diào)控。其中8個(gè)水稻鹽脅迫響應(yīng)miRNA 家族是不同物種間保守的通用鹽脅迫響應(yīng)miRNA。另外，從轉(zhuǎn)錄組水平挖掘出水稻鹽脅迫響應(yīng)tRF，并鑒定了6 個(gè)鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的tRF。

圖6 水稻根系中可能的鹽脅迫響應(yīng)miRNA 及tRF 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 The potential regulating network of salt-responsive miRNAs and tRFs in rice roots