王雨露， 許笑陽， 俞曉菡， 平 鍵,1b,2,3， 趙長青,1b,2,3

1 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 a.肝病研究所； b.肝二科， 上海 201203； 2 上海市中醫(yī)臨床重點實驗室， 上海 201203； 3 肝腎疾病病證教育部重點實驗室， 上海 201203

肝細胞癌(HCC)為最常見的原發(fā)性肝癌，是全球第六大惡性腫瘤。大多數(shù)HCC發(fā)生在肝硬化患者中，全世界高達80%的肝癌歸因于HBV、HCV感染。而在病毒感染率較低的西方國家，與酒精有關(guān)的肝病和非酒精性脂肪肝成為導致HCC的主要原因[1]。其他危險因素包括黃曲霉毒素、肥胖、原發(fā)性膽汁性肝硬化等[2-4]。HCC常在晚期時被發(fā)現(xiàn)，其惡性程度高，浸潤和轉(zhuǎn)移性強，因此被列為最致命的癌癥之一。目前HCC的治療包括外科手術(shù)方面取得了一些進展，但由于其發(fā)生缺乏可靠的生物標志物，且異質(zhì)性遺傳和表觀遺傳學改變均不明確，預后不良，患者術(shù)后5年生存率仍難以令人滿意。在這種難治性惡性腫瘤發(fā)病率穩(wěn)步上升的背后，能否早期診斷與及時治療對取得遠期療效具有重要意義。氧化應激學說是HCC發(fā)生發(fā)展機制研究的重要學說之一，證據(jù)顯示自噬在HCC中發(fā)揮重要作用，且與氧化應激關(guān)系緊密。但二者在HCC中相互調(diào)節(jié)的機制至今尚未十分明確。本文主要對近年來氧化應激和自噬在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用進行綜述。

1 自噬與HCC

自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制，指細胞利用溶酶體，降解自身受損、變性或衰老的大分子物質(zhì)，以及細胞器的自我消化過程。當細胞發(fā)生自噬后，在自噬相關(guān)基因的調(diào)節(jié)下，細胞通過單層或雙層膜，包裹待降解的細胞質(zhì)或細胞器，形成囊泡狀的自噬體。自噬體再與溶酶體發(fā)生融合形成自噬溶酶體，由溶酶體內(nèi)的一系列水解酶，降解其內(nèi)所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞自身代謝和能量更新[5]。

自噬誘導的Ⅱ型細胞程序性死亡，除了在正常條件下能夠維持細胞穩(wěn)態(tài)，還在幫助細胞對抗氧化應激的防御機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在機體能量不足或其他壓力條件下，通過自我降解清除受損細胞器和有害物質(zhì)，來獲取細胞生存必須的營養(yǎng)和能量，實現(xiàn)細胞內(nèi)成分循環(huán)，以促進細胞存活[6]。相反，自噬失調(diào)則會對人類健康造成嚴重后果，如壓力過度引發(fā)的自噬會誘導細胞凋亡，導致細胞失去活性。尤其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬可能影響包括增殖生長和轉(zhuǎn)移在內(nèi)的所有致病步驟。因此，自噬是一把“雙刃劍”[7]。

自噬在癌癥中亦扮演著雙重角色，既作為抑癌因素抑制腫瘤，也作為促癌因素促進腫瘤發(fā)生，參與腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。研究[9]認為，正常情況下自噬是一種抑制腫瘤發(fā)生的機制，通過清除受損細胞器，降低細胞內(nèi)壓力從而減少癌變；或通過介導細胞凋亡、抑制炎癥和免疫反應來清除癌細胞，以阻止癌癥的進展；同時，調(diào)控內(nèi)皮細胞自噬能夠抑制腫瘤血管的生成。相反，一旦癌癥發(fā)生，自噬將轉(zhuǎn)為促癌機制，通過為腫瘤細胞提供營養(yǎng)能量和增強腫瘤細胞抵抗放化療能力，來維持腫瘤細胞的穩(wěn)定性，促進腫瘤發(fā)展[10-11]。

1.1 自噬對于肝癌的抑制作用 在肝癌中，肝細胞降解主要依賴自噬，清除過量聚集的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和受損的線粒體，以防止過多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成[12]導致氧化應激。HCC的進展與持續(xù)性炎癥刺激高度相關(guān)，自噬通過抑制炎癥來阻止這種進展，而抑制自噬則引起炎癥水平升高。相關(guān)的動物實驗[9,13]顯示，與野生型對照相比，在感染性休克的ATG16L1敲除小鼠中，發(fā)現(xiàn)缺乏自噬反應，且與炎癥相關(guān)的IL-1β和IL-18細胞因子水平升高，這證明了自噬抑制炎癥的能力。另有研究[14]表明，在人肝癌組織中，能夠抑制自噬的趨化因子CXCL17表達明顯升高，這與肝癌組織學分期及預后不良有關(guān)；在體外實驗中，CXCL17的高表達也能促進細胞增殖和遷移，而沉默CXCL17誘導自噬，則發(fā)現(xiàn)腫瘤體積減小伴重量減輕，提示自噬減輕腫瘤發(fā)展。Beclin1是一種與肝癌相關(guān)的自噬蛋白，并與腫瘤復發(fā)有關(guān)，Beclin1基因敲除的小鼠在胚胎期致死，而異種Beclin1小鼠則發(fā)展為自發(fā)性肝癌[15]。該蛋白在人肝癌組織中被觀察到表達下降，比在正常肝細胞中低，這也提示自噬具備腫瘤抑制作用[16]。一項用腎上腺素治療肝癌小鼠的實驗[17]顯示，腎上腺素通過激活腎上腺素能受體，破壞Beclin1/VPS34/ATg14復合物來抑制細胞自噬，引起肝損傷加重，導致腫瘤體積增大伴數(shù)量增多。自噬還被證明有助于增強IFNγ來抑制癌細胞擴散，IFNγ多向性細胞因子可促進腫瘤細胞抗病毒和抗增殖，在HCC細胞中刺激自噬細胞體形成以抑制細胞生長。沉默自噬能夠消除IFNγ的抑制作用，這表明自噬具有抗腫瘤活性[18]。

多個自噬靶向的miRNA包含自噬調(diào)節(jié)基因也可能參與HCC過程。在HCC中，抑癌miR-7水平顯著下調(diào)，其通過上調(diào)靶向mTOR通路增強自噬活性，導致癌細胞增殖減少。抑癌miR-185在人肝癌細胞株HepG2中，通過轉(zhuǎn)染上調(diào)自噬活性，引起細胞周期阻滯。而miR-375在肝癌細胞株和組織中均下調(diào)，其通過下調(diào)肝癌細胞自噬相關(guān)蛋白(autophagy related protein, ATG)7抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，從而抑制肝癌細胞自噬。在miR-375過表達的裸鼠實驗中證實腫瘤生長速度及大小顯著降低[19]。以上研究為支持自噬對肝癌的抑制作用提供了證據(jù)。

1.2 自噬對于肝癌的促進作用 HCC發(fā)生過程中氧化應激導致大量ROS堆積，自噬相關(guān)蛋白p62通過激活Keap1/Nrf2系統(tǒng)防御氧化應激，參與蛋白聚集螯合及凋亡。相關(guān)研究[20]表明，肝臟中的腫瘤抑制蛋白DDX5與p62結(jié)合，能夠干擾p62/TRAF6的相互作用，從而誘導自噬，DDX5在人肝癌組織中的表達低于非腫瘤組織，提示自噬引起p62蛋白過度累積，繼而促使肝癌細胞生長和增殖。低氧誘導的自噬在肝細胞和肝癌細胞中依賴于缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor, HIF)1α，其上調(diào)BNIP3及BNIP3L蛋白與BCL-2蛋白的結(jié)合，從而抑制BCL-2和Beclin1之間的相互破壞作用，誘導細胞自噬以在低氧條件下存活。此外，在人肝癌細胞株中，低氧誘導的早期生長反應基因EGR-1的上調(diào)誘導自噬，促進HCC細胞遷移。自噬還可以通過釋放、降解損傷相關(guān)模式分子來調(diào)節(jié)炎性免疫應答，其中自噬介導的高遷移率族蛋白(high mobility group box 1, HMGB1)在壞死或凋亡的肝細胞中被釋放出來，誘導細胞存活和調(diào)控凋亡程序。HMGB1的細胞內(nèi)易位促進了其與胞質(zhì)中mtDNA的相互作用，以共同激活TLR9信號通路，促進腫瘤生長[21-22]。

自噬在HCC轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮了促進作用，腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)現(xiàn)自噬的表達上調(diào)。當原發(fā)性腫瘤生長并遭遇惡劣的微環(huán)境時，部分腫瘤在循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生逃逸，進入全身循環(huán)，定位于遠端器官。另外，自噬能夠引起細胞黏附信號的改變，引發(fā)癌細胞侵襲和遷移[23]，HCC的自噬通過上調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表達來促進轉(zhuǎn)移。研究[24]表明，通過沉默Beclin1和ATG5抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的自噬，可顯著降低肝癌向肺遠端轉(zhuǎn)移。

2 氧化應激與HCC

氧化應激是指細胞氧化還原失衡，引起過量ROS堆積，或抗氧化能力下降，導致機體氧化物和抗氧化系統(tǒng)之間失衡而造成的應激狀態(tài)。ROS是體內(nèi)氧化還原反應的正常產(chǎn)物，由正常代謝產(chǎn)生或由吸煙、輻射、粉塵等外源因素誘導，引起脂質(zhì)過氧化反應，導致DNA鏈斷裂，氧化生物膜和組織中的分子，造成損傷。然而，由于機體能夠在一定程度上清除ROS，低通量ROS介導的氧化還原信號可調(diào)節(jié)細胞周期和細胞增殖，并發(fā)揮核心作用；高通量ROS則引起靶分子的不可逆改變，從而損傷細胞，引起氧化還原穩(wěn)態(tài)的持續(xù)失衡，最終致使細胞死亡[25]。這顯示出保持氧化還原平衡的必要性。

在癌癥中，氧化應激水平通常會增加，不同的增殖信號如生長因子受體與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的結(jié)合，引起ROS產(chǎn)生增多[26]。DNA氧化損傷產(chǎn)生的DNA突變和不受控的細胞增殖屬于典型的ROS致瘤。有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路作為促細胞增殖和存活的重要通路之一，可通過氧化間接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，抑制MAP激酶磷酸酶Mkp3，或抑制MAPK亞家族成員Mkk6[27]。這證實一系列氧化還原反應影響激酶的活性，并參與細胞增殖相關(guān)通路的調(diào)控，促進腫瘤發(fā)生。

肝癌細胞的高增殖能力和持續(xù)性炎癥，都與氧化應激有關(guān)。Nrf2作為氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，在HCC中發(fā)揮重要作用。缺乏Nrf2的小鼠更易受到環(huán)境和細胞內(nèi)壓力的影響，導致DNA損傷而促進癌癥發(fā)生，激活Nrf2則可抑制腫瘤。在肝癌中，HBV基因組編碼X蛋白(HBx)與線粒體中ROS的增加相關(guān)[28]；體外感染HCV的人肝癌細胞，和表達HCV核心蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟，均觀察到氧化DNA損害即8-氧化鳥嘌呤(8-oxyoguanine, 8-oxoG)水平增加[29]，HCV介導的ROS改變線粒體功能；酒精引起的氧化應激失衡表現(xiàn)為黃嘌呤氧化酶促進ROS[30]；由三酰甘油限速酶釋放的脂肪酸能夠激活過氧化物酶體增殖物激活受體，從而影響抗氧化反應，也影響著肝癌的發(fā)展[31]。氧化應激一方面直接在DNA上形成8-oxoG或脂質(zhì)過氧化引起畸變，另一方面通過表觀遺傳機制促進肝癌發(fā)生。肝癌細胞中的位點特異性表觀遺傳學改變，包括H2O2處理引起的E-cadherin啟動子甲基化，和HBV誘導的線粒體ROS積累而發(fā)生的細胞因子信號抑制因子SOCS3的甲基化[32]?？偟膩碚f，ROS水平的增加是基因遺傳和表觀遺傳突變及增殖信號的原因，抗氧化劑導致的ROS失衡會引起細胞死亡。

3 自噬與氧化應激的相互作用及其調(diào)控機制

氧化應激可誘導自噬，也可誘導凋亡或壞死。從細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的角度來看，自噬是對氧化應激的一種重要反應，ROS又可以通過多種途徑激活自噬(圖1)。Nrf2-Keap1系統(tǒng)是抗氧化應激的主要防御機制之一，HCC中Nrf 2的激活可能是獨立發(fā)生的，也可能依賴于p62積聚和自噬途徑激活?？寡趸鞍譔rf2通過自噬上調(diào)，自噬蛋白p62磷酸化后與Nrf2抑制蛋白Keap1結(jié)合，引起Nrf2釋放，Nrf2進一步結(jié)合sMaf、JunD、ATF4、ARE形成復合物來調(diào)節(jié)抗氧化反應。通過p62的過量積累，Nrf2的持續(xù)激活直接促進了腫瘤發(fā)展，證實自噬誘導抗氧化通路的激活。Nrf2的持續(xù)激活在促進自噬缺失的肝腫瘤中起關(guān)鍵作用，這在ATG5肝臟特異性敲除小鼠中亦得到證實，自發(fā)進展為炎癥、肝纖維化和肝臟腫瘤，在沒有Nrf2的情況下這種現(xiàn)象被消除[33]。

ROS介導的自噬與HCC的生存機制和壓力條件相關(guān)，自噬活性和ROS在缺血再灌注損傷期間均增加，利于HCC細胞的增殖和存活[34]。自噬抑制ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵機制是通過自噬去除受損的線粒體，線粒體可以降解腫瘤抑制因子p53，線粒體損傷則導致p53的積累。其選擇性吞噬BCL2相互作用蛋白3(BNIP3)和NIP樣蛋白X(Nix)銜接蛋白，與E3泛素連接酶結(jié)合。隨著營養(yǎng)缺乏，HIF作為缺氧反應的主要調(diào)節(jié)因子，能夠促進BNIP3和Nix表達等自噬關(guān)鍵蛋白的轉(zhuǎn)錄[35]。Parkin蛋白敲除小鼠肝細胞增殖模型表明，Parkin蛋白可抑制HCC的發(fā)展。研究[36]發(fā)現(xiàn)，在ROS介導的乙醇致肝癌作用下，Parkin依賴的線粒體被激活。因此，在Parkin敲除的小鼠肝臟中，酒精誘導廣泛的線粒體損傷和氧化應激，表現(xiàn)出線粒體自噬。并且在功能障礙線粒體中與乙醇處理大鼠肝臟中積累的8-oxoG呈高度一致性[37]。在慢性酒精性肝損傷中，顯示自噬對CYP2E1依賴性氧化應激反應的細胞保護作用[38]。

文獻[39]顯示，氧化應激誘導線粒體自噬還可以抑制HCC遷移。相反，過度激活自噬則可能導致自噬細胞死亡。H2O2介導的ATG4被抑制，不能清除LC3，從而促進其與自噬體p62結(jié)合，進而促進自噬水平增高。此外，ROS還可影響參與自噬的其他信號通路，自噬關(guān)鍵分子mTOR激酶的激活被Akt和MAPK信號通路抑制，蛋白激酶Akt誘導促進生存的自噬，維持HCC中p53的降解和核因子NF-κB的表達[40]；而負調(diào)控mTOR的通路如對氧化應激敏感的蛋白激酶AMPK和p53信號通路促進自體吞噬[41]。在應激條件下，依賴于ROS的p38的激活，也是抑制癌細胞自噬激活的必要條件[42]。綜上，自噬與遺傳改變的信號通路PI3K/Akt/mTOR/Ras/Raf/MAP激酶和Wnt-β連環(huán)蛋白通路交互，其中大部分由ROS觸發(fā)。以上進一步表明了ROS與自噬之間的復雜聯(lián)系在受遺傳和慢性環(huán)境損害影響時可能促進HCC進展(圖1)。

4 結(jié)語

目前，對肝癌細胞內(nèi)和細胞外不同刺激條件下參與自噬復雜協(xié)調(diào)反應的應激信號通路了解甚少。氧化應激作為與HCC相關(guān)的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與導致HCC發(fā)病的多種環(huán)境風險因素相關(guān)。在氧化應激和營養(yǎng)缺乏等應激條件下，自噬也是與其他應激反應通路協(xié)調(diào)運行的重要途徑，在HCC中扮演雙重角色。自噬對HCC的發(fā)生發(fā)展既有促進作用，也有抑制作用，受損的自噬產(chǎn)生應激反應，增加發(fā)生肝細胞損傷和癌癥病變的風險。氧化應激與自噬的相互作用對HCC的治療效果具有很大影響，通過調(diào)節(jié)p62介導的Nrf2-Keap1這一關(guān)鍵信號通路，自噬直接參與調(diào)節(jié)氧化應激反應。p62對Nrf2- keap1通路的交互調(diào)節(jié)作用已被確定為HCC的潛在抗癌治療靶點[43]。進一步闡明氧化應激與自噬在HCC中的作用機制還需要更深入的研究，改善腫瘤氧合或抑制缺氧誘導的自噬信號可能是潛在的治療途徑。