張麗云， 鄧家琦， 張 雙， 鄧華江， 李曉紅

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a.健康管理中心； b.超聲醫(yī)學(xué)科； c.老年病科； d.神經(jīng)外科， 四川 瀘州 646000

脂肪肝是一種可逆性肝病，超重、肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、慢性酒精中毒以及HBV和HCV感染都有可能誘發(fā)脂肪肝[1]。脂肪肝最終有可能發(fā)展為肝纖維化，并導(dǎo)致肝硬化和肝癌。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是病理變化與酒精性肝病相似但無(wú)過量飲酒史的臨床綜合征，好發(fā)于中年特別是超重肥胖個(gè)體，其發(fā)病率在西方國(guó)家非常高[2]。隨著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及物質(zhì)生活水平的顯著提高，高能量的膳食密度、不健康的生活方式越來(lái)越普遍，NAFLD也成為愈來(lái)愈重要的慢性肝病問題[3]。NAFLD作為一種與遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激密切相關(guān)的疾病，以肝細(xì)胞內(nèi)過量脂肪沉積為特征，并且常與肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血癥等代謝性紊亂相伴，是一種從單純的脂肪變性、無(wú)炎癥或纖維化到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的一系列疾病[4]，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其通過RNA聚合酶Ⅱ從基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄，與mRNA相比，幾乎沒有已知的生化差異[5]。近年來(lái)研究[6]發(fā)現(xiàn)，lncRNA的異常調(diào)控與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，lncRNA在細(xì)胞中通過多種方式參與基因調(diào)控和蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝，參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展[7]。課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，lncRNA外泌體復(fù)合物7(lncRNA exocyst complex component 7，lncRNA EXOC7)在NAFLD患者組織中高表達(dá)，提示lncRNA EXOC7可能與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time PCR)檢測(cè)lncRNA EXOC7在NAFLD患者肝組織及血液標(biāo)本中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年1月1日-2018年12月31日在本院住院行肝穿刺并經(jīng)影像學(xué)及組織病理學(xué)確診為NAFLD的患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2012年美國(guó)NAFLD診療指南[8]。另選取同期于本院體檢的無(wú)脂肪變性和脂肪性肝炎的其他肝病(主要包括輕型藥物性肝損傷、慢性乙型肝炎)患者作為對(duì)照。本研究方案經(jīng)由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：20121201)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo) 收集所有研究對(duì)象的病理穿刺組織標(biāo)本，并于診斷明確后次日清晨空腹采集靜脈血5 ml，靜置2～4 h，2500～3000 r/min離心10 min；將離心獲得的血清分裝后用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。記錄LDL-C、HDL-C、TC、TG、ALT、AST、ALP、GGT、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平。根據(jù)CT影像學(xué)表現(xiàn)將NAFLD患者分為輕度(0.7<肝/脾CT比值<1.0)、中度(0.5<肝/脾CT比值≤0.7)和重度(肝/脾CT比值≤0.5)脂肪肝組。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)lncRNA EXOC7表達(dá)水平 采用TRIzol(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)提取組織及血清標(biāo)本中總RNA。將提取的總RNA參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix，以cDNA為摸板，進(jìn)行Real-time PCR(7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Applied Biosystems公司，美國(guó))。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入120例NAFLD患者，其中非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)患者47例(男25例、女22例)，NASH患者73例(男43例、女30例)。對(duì)照組納入50例患者(男25例、女25例)，其中輕型藥物性肝損傷25例，慢性乙型肝炎25例。

兩組一般資料比較，年齡、性別比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，而BMI、腰臀比、HDL-C、LDL-C、TC、TG、ALT、AST、ALP、GGT、hs-CRP、胰島素敏感指數(shù)(ISI)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 lncRNA EXOC7表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，NAFL和NASH患者的組織及血清中l(wèi)ncRNA EXOC7表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；而lncRNA EXOC7在NAFL與NASH患者組織、血清中的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

2.3 血清lncRNA EXOC7在不同程度非酒精性脂肪肝變性中的表達(dá) lncRNA EXOC7的表達(dá)水平隨肝臟脂肪變性及炎癥程度的加重而升高(F=19.96，P<0.05)，其在輕、中、重度非酒精性脂肪肝患者血清中的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P值均<0.05)(圖1)。

2.4 lncRNA EXOC7表達(dá)與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，lncRNA EXOC7表達(dá)與TG、LDL-C水平呈正相關(guān)(r值分別為0.785、0.847，P值均<0.001)(圖2a、b)；而與ISI和HDL-C水平呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.709、-0.726，P值均<0.001)(圖2c、d)。

2.5 lncRNA EXOC7表達(dá)對(duì)NAFLD的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，lncRNA EXOC7診斷NAFLD的曲線下面積為0.812(95%可信區(qū)間：0.599～0.915，P<0.001)，敏感度為85.42%，特異度為81.17%(圖3)。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 lncRNA EXOC7表達(dá)情況比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05。

圖1不同程度NAFLD患者血清lncRNAEXOC7的表達(dá)

3 討論

近年來(lái)NAFLD的發(fā)病率逐年上升且漸趨低齡化[9]。中國(guó)面臨NAFLD和高脂血癥的嚴(yán)重威脅，我國(guó)各類脂代謝紊亂患者約3億人，患病率約25%。NAFLD是導(dǎo)致肝硬化、門靜脈高壓、肝移植及肝癌的重要原因[10]。對(duì)于超重和肥胖者而言，NAFLD的出現(xiàn)，可能提示“惡性肥胖”[11]，這類人群更易并發(fā)血脂異常癥、糖尿病、高血壓，從而導(dǎo)致冠心病、中風(fēng)的概率顯著增加。目前，NAFLD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，治療缺乏有效藥物[12]。因此，闡明NAFLD發(fā)病機(jī)制并尋找有效的防治方法是目前臨床亟待解決的難題。

lncRNA是一組長(zhǎng)度>200 nt的不具有編碼蛋白功能的RNA轉(zhuǎn)錄本，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生理功能[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)lncRNA參與肝臟細(xì)胞多種生物學(xué)過程，在很多肝臟病理過程中發(fā)揮重要作用，與線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、能量代謝高度相關(guān)。在所有生物過程中，NAFLD發(fā)生變化最主要的3種生物過程，即RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)、節(jié)律過程以及脂肪酸代謝過程，與lncRNA調(diào)控的翻譯、羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)、有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)[15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-NEAT1通過調(diào)節(jié)miR-146a-5p/ROCK1促進(jìn)NAFLD肝臟脂質(zhì)積聚。下調(diào)lncRNA SNHG20的表達(dá)可通過調(diào)節(jié)肝Kupffer細(xì)胞極化延緩NAFLD向肝細(xì)胞癌的發(fā)展[17]。lncRNA FRRL2通過ARNTL-SIRT1通路減緩NAFLD的發(fā)生[18]。lncRNA NEAT1-Microrna-140 環(huán)通過阻斷AMPK/SREBP-1信號(hào)促進(jìn)NAFLD的發(fā)生[19]。lncRNA-H19通過直接調(diào)節(jié)miR130a/PPARγ軸促進(jìn)NAFLD脂肪合成[20]。通過抑制MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中l(wèi)ncRNA HULC的表達(dá)可促進(jìn)NAFLD大鼠肝纖維化和肝細(xì)胞凋亡[21]。lncRNA MIRT2通過海綿吸附miR-34a-5p，從而上調(diào)USP10的表達(dá)抑制肝脂肪變性[22]。lncRNA MEG3作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-21到低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6調(diào)節(jié)肝臟的脂肪生成[23]。以上研究均提示lncRNA在NAFLD中發(fā)揮著重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA EXOC7在NAFLD患者組織及血清標(biāo)本中表達(dá)明顯增高，且表達(dá)水平隨肝臟脂肪變性及炎癥程度的加重而提升；進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA EXOC7表達(dá)與TG、LDL-C呈正相關(guān)，而與HDL-C、ISI呈負(fù)相關(guān)。lncRNA EXOC7診斷NAFLD的ROC曲線下面積為0.812(95%可信區(qū)間：0.599～0.915)，敏感度為85.42%，特異度為81.17%。以上研究結(jié)果提示，lncRNA EXOC7可能是NAFLD防治的潛在新靶點(diǎn)。