許 杰， 劉 艷， 樓汪洲洋， 徐 俊， 戚 露， 程良斌

1 湖北中醫(yī)藥大學 a.中醫(yī)臨床學院; b.信息工程學院; c.感染病學教研室，武漢 430060；2 宜昌市中醫(yī)醫(yī)院 脾胃科， 湖北 宜昌 443000；3 湖北省中醫(yī)院 肝病科， 湖北省中醫(yī)院肝病研究所， 武漢 430061

肝纖維化病因較多，發(fā)病機制復雜，是多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝癌的重要一環(huán)[1-5]。據(jù)統(tǒng)計，各種原因?qū)е赂卫w維化的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)居高不下，并逐年升高，肝纖維化產(chǎn)生的諸多并發(fā)癥嚴重威脅患者的生命健康，并對社會造成更為巨大的醫(yī)療負擔[6]，及時準確的診斷和防治肝纖維化，對于防治肝硬化與肝癌有著極其重要的意義[7]。

肝竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)是構(gòu)成肝竇的主要細胞，具有較多的窗孔而構(gòu)成篩狀，且內(nèi)皮下無基底膜的存在，以助于肝細胞與血竇中各種成分的交換。肝纖維化病變時，肝竇毛細血管化，LSEC失去窗孔結(jié)構(gòu)，同時內(nèi)皮下基底膜形成，導致肝細胞和血竇之間的物質(zhì)交換障礙，進而引起肝竇塌陷及肝細胞萎縮，最終導致肝纖維化和門靜脈高壓的發(fā)生；此外，LSEC表型也發(fā)生較大改變，表達血管內(nèi)皮標志物分化抗原簇31(cluster of differentiation 31，CD31)和血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)[8]。在對肝竇毛細血管化的評判中，認為各種原因所致的肝纖維化過程中肝竇毛細血管化可作為肝纖維化的最基本特征[9]。目前，肝竇毛細血管化形成的具體機制及其發(fā)生、發(fā)展影響因素仍不清楚。對肝竇毛細血管化形成原因、過程以及影響因素等方面進行研究，能為進一步揭示肝纖維化、肝硬化病理過程及阻斷肝硬化病理進程提供理論依據(jù)[10]。

抗纖軟肝方是湖北省中醫(yī)院肝病科抗肝纖維化的臨床效方，現(xiàn)為院內(nèi)中成藥制劑(批準文號：鄂藥制字Z20113145)。主要藥物由鱉甲、牡蠣、丹參、海藻、莪術(shù)等組成，具有軟肝消痰、活血化瘀的功效，臨床療效已通過實驗科學驗證和臨床認可[11-18]，課題組前期的研究已表明，抗纖軟肝方可以有效改善患者肝功能，降低肝纖維化指標，但其藥理學作用機制及生物學效應的物質(zhì)基礎(chǔ)仍未明確。 本研究擬從肝竇毛細血管化角度探討抗纖軟肝方抗肝纖維化的藥理學作用機制。

1 材料與方法

1.1 化學藥品和試劑 抗纖軟肝顆粒為湖北中醫(yī)院院內(nèi)制劑。蛋白質(zhì)提取試劑盒購自武漢阿斯彭生物科技有限公司(武漢，中國)；兔抗大鼠vWF(工作濃度為1∶150)、山羊抗大鼠CD31(工作濃度為1∶50)購自Abcam公司(Cambridge,MA, 美國)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和兔抗山羊IgG、DAB顯色試劑盒、小鼠抗大鼠β-actin、ECL超敏化學發(fā)光檢測試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司(武漢，中國)；FBS和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.2 含藥血清與細胞培養(yǎng)基的制備 本研究經(jīng)由湖北省中醫(yī)院動物倫理委員會審批[批號：鄂中醫(yī)院動(福)D2018014號]，所有實驗操作均符合動物實驗管理規(guī)范。Wistar雄性大鼠16只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，購自湖北省疾控中心。將大鼠分為抗纖軟肝方組和對照組，每組各8只。藥物劑量為60 kg成人等體質(zhì)量常用劑量的6倍量，抗纖軟肝方組生藥40 g/kg大鼠體質(zhì)量灌胃，灌胃容量為10 ml/kg大鼠體質(zhì)量。采取二次重復給藥的方式，即第1次灌胃給藥2 h后以相同的劑量重復給藥1次，第2次給藥后1 h于超凈臺中自下腔靜脈采血，再將收集的血液靜置于4 ℃冰箱3 h，后4 ℃離心機中離心(3000 r/min，30 min)，超凈臺中分離血清，再于56 ℃水浴箱中滅活30 min，冷卻后-20 ℃冰箱保存，即為抗纖軟肝方組血清；對照組用生理鹽水代替抗纖軟肝方藥物給大鼠灌胃，余處理均與抗纖軟肝方組相同，獲取對照組血清?？估w軟肝方組血清與對照組血清均分別以10%的濃度加入DMEM配置成含血清培養(yǎng)基用以細胞培養(yǎng)。最后將配制的培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm濾器除菌待用。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組 原代LSEC，由武漢原生原代生物公司提供，經(jīng)傳代培養(yǎng)后分為抗纖軟肝方組(母方組，MF)及對照組(Control)，分別用10%濃度的含藥血清和對照血清進行培養(yǎng)，置于37 ℃含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 血免疫細胞化學法 接種于鋪有蓋玻片的6孔板，培養(yǎng)48 h后檢測，一抗分別為兔抗大鼠vWF和山羊抗大鼠CD31，二抗分別為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG。細胞爬片經(jīng)固定、破膜、封閉、抗體孵育及DAB顯色后，顯微鏡下觀察并拍照，每張載玻片上取8個高倍視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行吸光度值分析。

1.4.2 Western Blot 用SDS-PAGE凝膠電泳分離的原代LSEC提取物行蛋白質(zhì)印跡檢測，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜過濾器上。含5%脫脂奶的PBS溶液封閉過夜，檢測vWF和CD31一抗工作濃度分別為1∶1000和1∶200，內(nèi)參β-actin工作濃度為1∶2000，經(jīng)一抗和二抗孵育及ECL超敏化學發(fā)光檢測試劑盒曝光，曝光15 min，用Image Lab軟件進行灰度值測量分析。

1.4.3 掃描電鏡觀察肝竇內(nèi)皮窗孔的變化 6孔板中經(jīng)抗纖軟肝方血清與對照血清培養(yǎng)的LSEC，PBS清洗3次后，每孔加入2 ml的電鏡固定液，4 ℃冰箱保存，進行掃描電鏡檢測LSEC窗孔結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果

2.1 抗纖軟肝方對LSEC形態(tài)的影響 采用免疫細胞化學法對原代LSEC進行鑒定，經(jīng)復合染色確定為原代LSEC(圖1a)。采用倒置顯微鏡觀察LSEC的形態(tài)，與對照組比較，抗纖軟肝方組對LSEC形態(tài)學無明顯影響(圖1b)。

注：a，免疫細胞化學法對LSEC鑒定(×200)；b，抗纖軟肝方對LSEC形態(tài)影響(×100)。

圖1LSEC鑒定與形態(tài)學觀察

2.2 抗纖軟肝方對LSEC中CD31和vWF細胞因子的影響 在LSEC中CD31主要表達在胞質(zhì)中，vWF在胞質(zhì)和胞核中均有表達。與對照組比較，抗纖軟肝方組CD31和vWF表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(CD31: 0.069±0.015 vs 0.115±0.011,t=4.257,P<0.05; vWF: 0.092±0.009 vs 0.132±0.014,t=4.274,P<0.05)(圖2)。

2.3 抗纖軟肝方對LSEC窗孔結(jié)構(gòu)的影響 如圖3所示，對照組LSEC表面窗孔狹小，數(shù)量減少，許多窗孔結(jié)構(gòu)將近閉塞甚至消失;而抗纖軟肝方組LSEC窗孔結(jié)構(gòu)清晰，窗孔增多、增大，明顯可見，且基底膜明顯減少。

2.4 抗纖軟肝方對LSEC分子機制的影響 與對照組相比，經(jīng)抗纖軟肝方組治療后CD31、vWF的蛋白水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義(CD31：0.334±0.029 vs 0.448±0.013,t=6.245,P<0.01; vWF: 0.560±0.047 vs 0.709±0.045,t=3.966,P<0.05)(圖4)。

3 討論

當前，肝纖維化無創(chuàng)性診斷和有效干預尚不盡人意，單一藥物的療效可能有限，可能需要聯(lián)合及多靶點嘗試治療[19]。對于肝纖維化的防治，大量研究[20-22]表明，通過早期及時診斷并針對其原發(fā)致病因素的有效治療，肝纖維化能被有效阻斷，甚至逆轉(zhuǎn)，可以達到肝硬化不同程度的減輕與緩解。對肝竇毛細血管化的研究已有半個多世紀，而進一步加強對肝竇毛細血管化的研究，對于闡明肝纖維化的發(fā)病進展機制以及逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化方面，意義深遠[9]。肝竇毛細血管化的具體分子機制至今仍未清楚，而肝纖維化過程中肝竇毛細血管化與肝星狀細胞、Kupffer細胞活化之間的關(guān)系，LSEC與細胞微環(huán)境之間關(guān)系的研究已經(jīng)成為目前肝纖維化具體分子機制研究的熱點問題。

近年針對肝纖維化的不同靶點、抑制肝星狀細胞活化與增殖、增強基質(zhì)金屬蛋白酶活性及抑制金屬蛋白酶組織抑制劑的活性、抑制炎癥反應、調(diào)節(jié)免疫反應的藥物及中藥，以及納米顆粒與抗纖維化藥物結(jié)合的治療和基因治療取得顯著的進展[5,23]?？垢卫w維化的治療，主要包括兩方面：一是針對原發(fā)病的病因治療，如抗肝炎病毒、抗血吸蟲病、戒酒、祛鐵和祛銅等控制或治愈原發(fā)病；二是針對抗肝纖維化本身的治療，也是目前臨床和實驗研究的熱點和重點，如抑制肝星狀細胞的激活、抑制膠原的增生、抑制TGFβ的過表達、促進膠原的降解等，但目前多數(shù)治療處于實驗研究階段[24-25]。

中醫(yī)認為肝纖維化為痰瘀互結(jié)之證，抗纖軟肝方具有軟肝消痰、活血化瘀的功效，進而起到抗肝纖維化的作用。本文通過細胞實驗研究，探討抗纖軟肝方對肝竇毛細血管化的作用機制和抗肝纖維化的效果，通過對肝纖維化原代LSEC免疫細胞化學、Western-Blot檢測和掃描電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，抗纖軟肝方具有明顯的抗肝竇毛細血管化，改善肝纖維化的作用。

LSEC既可以參與肝臟的再生，發(fā)揮保護作用，又可以參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[26]。原代LSEC在體外經(jīng)傳代培養(yǎng)，會發(fā)生毛細血管化現(xiàn)象，但其發(fā)生的分子機制仍不清楚[8]。為進一步從肝竇毛細血管化的角度明確抗纖軟肝方對肝纖維化的影響，本研究通過掃描電鏡檢測LSEC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組LSEC結(jié)構(gòu)不清，窗孔減少明顯，提示肝竇毛細血管化可能是肝纖維化痰瘀互結(jié)的重要病理學基礎(chǔ)。而抗纖軟肝方可明顯改善LSEC肝竇毛細血管化的表現(xiàn)，改善窗孔結(jié)構(gòu)，增加LSEC窗孔。

CD31、vWF是反映肝竇毛細血管化的重要客觀指標[27]。為深入探究抗纖軟肝方抗肝竇毛細血管化的分子機制，本研究通過Western-Blot和免疫細胞化學法測定LSEC中CD31、vWF的蛋白表達，結(jié)果表明，抗纖軟肝方組可顯著降低CD31、vWF的蛋白表達水平，明顯改善LSEC其肝竇毛細血管化程度，這可能是其改善LSEC肝竇毛細血管化，從而達到抗肝纖維化作用的分子機制之一。