白珊珊，莫思怡，徐嘯翔，劉 云，謝秋菲△，曹 燁△

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院， 1.修復(fù)科, 2.口頜功能診療研究中心 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081)

口頜面疼痛可由多種疾病引起，其機(jī)制尚未完全明確，也缺乏有效的治療手段[1-2]。臨床有部分患者因咬合干擾出現(xiàn)口頜面疼痛，甚至表現(xiàn)為廣泛的頜面部疼痛，影響患者身心健康，其機(jī)制研究具有重要意義。

評(píng)估各種動(dòng)物模型的疼痛程度是疼痛研究的重要方法，嚙齒類(lèi)動(dòng)物的疼痛可分為刺激誘發(fā)性疼痛(stimulus-evoked pain)與非刺激誘發(fā)性疼痛(non stimulus-evoked pain)[3-4]，分別對(duì)應(yīng)動(dòng)物行為的誘發(fā)反應(yīng)與非誘發(fā)反應(yīng)，如von Frey法、熱板測(cè)試等都是經(jīng)典的刺激誘發(fā)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物疼痛表情測(cè)量量表、操縱行為實(shí)驗(yàn)(operant behavior)、跑輪實(shí)驗(yàn)等均為非刺激誘發(fā)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)[3-4]。誘發(fā)反應(yīng)包括機(jī)械刺激及熱刺激誘發(fā)反應(yīng)，其中使用von Frey纖維是經(jīng)典的機(jī)械刺激誘發(fā)反應(yīng)測(cè)試方法[5-6]，當(dāng)所使用的von Frey纖維刺激超過(guò)疼痛閾值后，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)抓臉、理毛、回避等行為，研究者通過(guò)這些行為判定疼痛，該方法操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)測(cè)量。但是，有研究指出這些行為均屬于受腦干支配的反射行為[7]，另外，該方法對(duì)疼痛的評(píng)估主要依賴(lài)于研究者的操作與判斷，較易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)者偏倚[7-9]。動(dòng)物的非刺激誘發(fā)疼痛與人類(lèi)的自發(fā)性疼痛和背景疼痛(background pain)相似，非刺激誘發(fā)疼痛均可歸于此類(lèi)。人類(lèi)的疼痛行為多為非刺激誘發(fā)反應(yīng)，行為復(fù)雜，因此使用多種行為學(xué)方法研究這些行為學(xué)表現(xiàn)具有重要意義[3-4]。近年來(lái)，Neubert等[9]創(chuàng)建了行為學(xué)方法——口頜面自我賞罰實(shí)驗(yàn)(orofacial operant test)，此方法基于操縱行為測(cè)試(operant behavior test)，旨在通過(guò)獎(jiǎng)賞-懲罰模式評(píng)價(jià)動(dòng)物的疼痛表現(xiàn)[8-10]。自我賞罰實(shí)驗(yàn)允許動(dòng)物在接受獎(jiǎng)賞或逃避傷害性刺激間做出選擇，與誘發(fā)反應(yīng)測(cè)試方法相比更為客觀(guān)，更能反映動(dòng)物高級(jí)中樞對(duì)傷害性刺激加工后的表現(xiàn)[9-11]。

三叉神經(jīng)病理性疼痛模型與咬合干擾模型(experimental occlusal interference, EOI)均是口頜面疼痛研究中的重要?jiǎng)游锬Ｐ停嫔窠?jīng)病理性疼痛模型的大鼠表現(xiàn)出明顯的口頜面誘發(fā)疼痛反應(yīng)(如機(jī)械刺激反應(yīng)閾值下降)和自發(fā)性反應(yīng)(如術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)特定的疼痛表情及異常的面部梳理行為)[12-15]。相關(guān)模型包括眶下神經(jīng)慢性縮窄模型(chronic constriction injury of the infraorbital nerve，ION-CCI)、部分眶下神經(jīng)結(jié)扎模型(partial infraorbi-tal nerve ligation，pIONL)、部分眶下神經(jīng)切斷模型(partial infraorbital nerve transection，pIONX)等，既往已有關(guān)于ION-CCI模型與pIONL模型的自我賞罰實(shí)驗(yàn)研究[8,16]。EOI模型包括在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牙齒上加冠、咬合板等方式施加咬合干擾形成口頜面疼痛模型[12-13]，既往研究中未見(jiàn)此動(dòng)物模型的自我賞罰實(shí)驗(yàn)相關(guān)研究。

本課題組的前期研究建立了成熟穩(wěn)定的EOI模型和神經(jīng)病理性疼痛模型，并對(duì)誘發(fā)痛敏行為學(xué)有較深入的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在將自我賞罰實(shí)驗(yàn)引入EOI模型，探索新的頜面部行為學(xué)研究方法，同時(shí)測(cè)定神經(jīng)病理性疼痛模型的自我賞罰實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果，比較不同疼痛模型的痛敏特點(diǎn)異同，并將兩種模型的自我賞罰實(shí)驗(yàn)結(jié)果與誘發(fā)反應(yīng)結(jié)果相對(duì)比，以期能全面反映不同疼痛模型的疼痛特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley SPF級(jí)大鼠60只，初始體質(zhì)量180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011]，飼養(yǎng)于北京大學(xué)口腔醫(yī)院[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0007]。24 h晝夜交替，室溫25 ℃，誘發(fā)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲食飲水，自我賞罰實(shí)驗(yàn)大鼠測(cè)試日預(yù)先禁食不禁水，其余時(shí)間自由飲食飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：LA2017091。

1.2 大鼠疼痛模型的建立

1.2.1大鼠EOI模型的建立 參考Cao等[17]的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后，取上頜藻酸鹽印模，灌制模型，制作右上第一磨牙鎳鉻合金牙冠，確定牙合面厚度為0.4 mm。大鼠于1%(體積分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉(40 mg/kg，Sigma，USA)全身麻醉下使用樹(shù)脂粘接劑(Panavia F，Kuraray，Japan)將牙冠粘固于大鼠右上第一磨牙。sham組大鼠為假手術(shù)組，操作步驟同手術(shù)組但不粘固牙冠。

1.2.2大鼠pIONX模型的建立 參考Cao等[18]的實(shí)驗(yàn)方法，大鼠在1%戊巴比妥鈉全身麻醉下，于右上第一磨牙前齦頰溝處行縱行切口，鈍性分離周?chē)M織，暴露眶下神經(jīng)分支。使用顯微外科剪剪斷約外側(cè)1/2的眶下神經(jīng)分支，術(shù)后縫合線(xiàn)縫合傷口。sham組大鼠為假手術(shù)組，操作步驟同手術(shù)組，但不進(jìn)行神經(jīng)切斷。

1.3 大鼠機(jī)械刺激誘發(fā)反應(yīng)閾值的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)大鼠在建模前4～6 d熟悉環(huán)境，實(shí)驗(yàn)者每日安撫大鼠30 min，之后使用von Frey纖維測(cè)定建模前與建模后固定時(shí)間點(diǎn)EOI組與pIONX組大鼠雙側(cè)觸須墊機(jī)械刺激反應(yīng)閾值。

1.4 大鼠自我賞罰行為學(xué)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)使用Ugo Basile面部疼痛測(cè)試儀(Ugo Basile Orofacial Stimulation Test System，ComerioVA，Italy)， 該儀器由標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物籠與測(cè)試單元連接而成，測(cè)試單元主要包括刺激裝置、食物獎(jiǎng)勵(lì)、紅外線(xiàn)探頭等部分，刺激裝置包括機(jī)械刺激模塊與溫度刺激模塊，提供頜面部機(jī)械與熱傷害性刺激。機(jī)械刺激裝置包括三種不同的密度模塊，模塊上分別設(shè)有不同數(shù)量的NiTi刺激絲，分別為(左側(cè)+右側(cè))6+6、9+9與13+13(圖1)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，動(dòng)物將頭探出窗口獲得食物獎(jiǎng)勵(lì)時(shí)會(huì)觸動(dòng)刺激裝置產(chǎn)生頜面部傷害性刺激，通過(guò)分析動(dòng)物忍受傷害性刺激時(shí)的攝食情況(攝食總時(shí)間與攝食總次數(shù))評(píng)估其疼痛程度。

具體測(cè)試方法參考Cha等[8]的研究，非測(cè)試期大鼠自由飲食飲水，測(cè)試日預(yù)先禁食，將大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物籠中，放置機(jī)械刺激模塊，提供食物獎(jiǎng)勵(lì)，大鼠經(jīng)過(guò)窗口獲得食物獎(jiǎng)勵(lì)時(shí)紅外裝置可自動(dòng)檢測(cè)該行為并將結(jié)果傳入計(jì)算機(jī)，大鼠經(jīng)過(guò)適應(yīng)期訓(xùn)練后，能夠忍受機(jī)械刺激間斷性獲取食物獎(jiǎng)勵(lì)。大鼠每次測(cè)試時(shí)均先熟悉環(huán)境，隨后打開(kāi)攝食窗口，測(cè)試大鼠固定時(shí)間段內(nèi)的攝食水平。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)研究的參數(shù)[8-10]進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)合EOI模型特點(diǎn)，最終將禁食時(shí)間確定為(20±1) h，食物獎(jiǎng)勵(lì)為30%(體積分?jǐn)?shù))煉奶(Nestle Carnation)，飲水瓶口與機(jī)械刺激間距離為14 mm，大鼠在攝食期間機(jī)械刺激位于觸須墊后方至咬肌前緣，機(jī)械刺激選擇中等密度模塊(9+9 NiTi刺激絲)。大鼠在進(jìn)入測(cè)試籠后先熟悉環(huán)境10 min，隨后打開(kāi)窗口，測(cè)試10 min攝食水平(攝食總時(shí)間與攝食總次數(shù))。

1.5 大鼠體質(zhì)量測(cè)量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

既往研究已證實(shí)EOI與pIONX模型的建立對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量無(wú)影響[17-18]。選擇與后續(xù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物起始體質(zhì)量接近的大鼠12只(自由飲食飲水大鼠6只與間斷性禁食大鼠6只)， 按照后續(xù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量并進(jìn)行比較。

1.6 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用盲法，大鼠隨機(jī)分為8組(每組6只)，4組為機(jī)械刺激誘發(fā)反應(yīng)組，以von Frey纖維測(cè)定機(jī)械刺激反應(yīng)閾值(分別為sham-EOI、EOI、sham-pIONX、pIONX組，sham為假手術(shù)組)；4組為自我賞罰實(shí)驗(yàn)組，以Ugo Basile口頜面疼痛測(cè)試儀測(cè)定自我賞罰實(shí)驗(yàn)行為學(xué)表現(xiàn)(分別為sham-EOI、EOI、sham-pIONX、pIONX，sham為假手術(shù)組)。

機(jī)械刺激誘發(fā)反應(yīng)組中的4組大鼠分別于建模前1～3 d及建模后1、3、7、10、14、21 d每天固定時(shí)間點(diǎn)測(cè)試，每側(cè)重復(fù)測(cè)試5次，每次間隔1 min，取平均值作為該側(cè)機(jī)械刺激反應(yīng)閾值。自我賞罰實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行2周適應(yīng)訓(xùn)練，熟悉自我賞罰行為學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器及人員，適應(yīng)訓(xùn)練成功的大鼠在測(cè)試期間可忍受頜面部傷害性刺激，間斷性獲得食物，且攝食水平穩(wěn)定。訓(xùn)練成功的大鼠在適應(yīng)訓(xùn)練期結(jié)束后，連續(xù)測(cè)定3次基線(xiàn)攝食水平，取平均值為基線(xiàn)攝食水平，測(cè)定基線(xiàn)后，分別于建模后1、3、7、10、14、21 d每天固定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行大鼠自我賞罰實(shí)驗(yàn)行為學(xué)測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，對(duì)自由飲食飲水大鼠與間斷性禁食大鼠的每次平均體質(zhì)量采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組間差異，對(duì)各組不同時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械刺激反應(yīng)閾值與自我賞罰行為學(xué)結(jié)果分別采用重復(fù)測(cè)量方差分析、Bonferroni后檢驗(yàn)，對(duì)各組相同時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械刺激反應(yīng)閾值與自我賞罰行為學(xué)結(jié)果進(jìn)行多因素方差分析、Bonferroni后檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠基本情況

自由飲食飲水大鼠與間斷性禁食大鼠在測(cè)試期間體質(zhì)量均出現(xiàn)緩慢增加，7 d開(kāi)始間斷性禁食大鼠的體質(zhì)量略低于自由飲食飲水大鼠，21 d兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.2 pIONX大鼠機(jī)械誘發(fā)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

機(jī)械刺激誘發(fā)反應(yīng)組中，sham-pIONX與pIONX組大鼠雙側(cè)機(jī)械刺激反應(yīng)閾值變化見(jiàn)圖3。pIONX組大鼠手術(shù)側(cè)與非手術(shù)側(cè)機(jī)械刺激反應(yīng)閾值均下降，1～21 d與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，7～10 d達(dá)到最低點(diǎn)，之后出現(xiàn)升高，但機(jī)械刺激反應(yīng)閾值持續(xù)至觀(guān)察終點(diǎn)仍未恢復(fù)至基線(xiàn)水平(P<0.05)，雙側(cè)機(jī)械反應(yīng)閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 pIONX大鼠自我賞罰實(shí)驗(yàn)結(jié)果

自我賞罰實(shí)驗(yàn)組中，sham-pIONX與pIONX組大鼠在建模后一周內(nèi)總攝食時(shí)長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但各時(shí)間點(diǎn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模7 d后，大鼠總攝食時(shí)長(zhǎng)下降，10～14 d最低，之后出現(xiàn)回升，但在測(cè)試末仍未回到基線(xiàn)水平，pIONX組大鼠建模后10、14、21 d總攝食時(shí)長(zhǎng)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與自身基線(xiàn)相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)期間兩組總攝食次數(shù)的各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

2.4 EOI大鼠機(jī)械誘發(fā)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

機(jī)械刺激誘發(fā)反應(yīng)組中，sham-EOI與EOI組大鼠雙側(cè)機(jī)械刺激反應(yīng)閾值變化見(jiàn)圖5。EOI組在施加0.4 mm咬合干擾后，機(jī)械刺激反應(yīng)閾值呈下降趨勢(shì)，但建模后1～3 d與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，之后機(jī)械刺激反應(yīng)閾值顯著下降，7～21 d與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，7 d達(dá)到最低點(diǎn)，之后有所回升，但持續(xù)至觀(guān)察終點(diǎn)差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EOI組大鼠干擾側(cè)與非干擾側(cè)機(jī)械刺激反應(yīng)閾值間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 EOI大鼠自我賞罰實(shí)驗(yàn)結(jié)果

自我賞罰實(shí)驗(yàn)組中，sham-EOI組大鼠攝食水平穩(wěn)定，總攝食時(shí)長(zhǎng)與總攝食次數(shù)各時(shí)間點(diǎn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 EOI組大鼠在建模后，總攝食時(shí)間顯著下降，與對(duì)照組相比，1～21 d差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，7～10 d最低，之后出現(xiàn)回升，但持續(xù)至觀(guān)察終末差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。建模后7、10、14 d總攝食時(shí)間與自身基線(xiàn)的對(duì)比結(jié)果差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)期間兩組的總攝食次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖6。

3 討論

3.1 疼痛評(píng)估的方法

目前認(rèn)為疼痛是一種多維的復(fù)合感覺(jué)，一個(gè)簡(jiǎn)單的痛覺(jué)過(guò)程至少包含三個(gè)維度：感覺(jué)維度、情緒維度和認(rèn)知維度[19]。動(dòng)物模型與疼痛行為評(píng)估均是疼痛研究的重要組成，一直以來(lái)，該領(lǐng)域的研究者們不斷創(chuàng)新、發(fā)展實(shí)驗(yàn)方法，以期能客觀(guān)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疼痛行為。動(dòng)物疼痛行為評(píng)估通常包括“反射行為”(reflexive behaviors)與“自愿行為”(voluntary reactions)，其中又包括非習(xí)得與習(xí)得行為[20]。不同評(píng)估方法可獲得不同信息，如動(dòng)物的屈肌反射中樞為脊髓，更復(fù)雜的非習(xí)得行為(如舔爪、發(fā)聲、理毛等)的中樞可能由腦干介導(dǎo)[20-23]，這些非習(xí)得行為在去大腦的動(dòng)物中也可觀(guān)察到[7]，較之更復(fù)雜的習(xí)得行為則需要經(jīng)過(guò)大腦加工處理，如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過(guò)操縱實(shí)驗(yàn)學(xué)會(huì)自我選擇食物或逃避傷害性刺激。因此，客觀(guān)評(píng)價(jià)習(xí)得行為更能反映高級(jí)中樞對(duì)傷害性刺激的整合，對(duì)研究疼痛的中樞機(jī)制具有重要意義。

3.2 咬合干擾致口頜面痛敏大鼠的自我賞罰實(shí)驗(yàn)

Ugo Basile口頜面疼痛測(cè)試儀是一種能夠評(píng)估反應(yīng)高級(jí)中樞對(duì)疼痛整合行為的儀器，曾用于研究三叉神經(jīng)病理性疼痛(眶下神經(jīng)慢性縮窄模型與眶下神經(jīng)部分結(jié)扎模型)、口頜面炎性痛模型，探索行為學(xué)特點(diǎn)及其相關(guān)機(jī)制[8-11,24]，在三叉神經(jīng)病理性疼痛研究中，多個(gè)實(shí)驗(yàn)均使用該方法評(píng)價(jià)了動(dòng)物模型的行為學(xué)特點(diǎn)，探索該模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏與冷刺激痛覺(jué)過(guò)敏的自我賞罰實(shí)驗(yàn)行為學(xué)表現(xiàn)[8-10]。

臨床上可觀(guān)察到咬合干擾相關(guān)口頜面疼痛患者的焦慮、抑郁等評(píng)分較高，更容易出現(xiàn)不穩(wěn)定情緒。動(dòng)物研究也提示，咬合問(wèn)題與情緒、精神心理等因素相關(guān)，如一項(xiàng)關(guān)于獼猴的研究顯示，功能失調(diào)的咬合關(guān)系可能導(dǎo)致與情緒壓力相關(guān)的磨牙癥[25]。顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders, TMD)相關(guān)口頜面疼痛研究顯示，咬合因素可能為T(mén)MD的危險(xiǎn)因素，而TMD患者多伴有心理問(wèn)題[26-27]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，海馬、前扣帶回等均參與了咬合干擾致口頜面痛敏的中樞機(jī)制[28-29]，提示該模型痛覺(jué)的產(chǎn)生與情緒認(rèn)知等相關(guān)。因此，使用自我賞罰實(shí)驗(yàn)方法可能更全面地反映該模型的行為學(xué)特點(diǎn)。

自我賞罰實(shí)驗(yàn)在既往的研究應(yīng)用中，測(cè)試前禁食時(shí)間多為12～15 h，機(jī)械刺激多選擇密度最低的機(jī)械刺激模塊(6+6 NiTi刺激絲)，食物獎(jiǎng)勵(lì)包括30%煉奶與20%蔗糖[8-11,30-31]。本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，設(shè)置三種不同密度NiTi刺激絲時(shí)，實(shí)驗(yàn)大鼠總攝食時(shí)間隨密度增加而降低，訓(xùn)練失敗的大鼠增多，但大鼠疼痛時(shí)總攝食時(shí)間的變化量增加，另一方面，隨禁食時(shí)長(zhǎng)增加，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總攝食時(shí)長(zhǎng)增加，EOI組大鼠使用最低密度NiTi刺激絲時(shí)，施加干擾后總攝食時(shí)間降低較少，綜上，我們最終選擇中等密度NiTi刺激絲與更長(zhǎng)的禁食時(shí)間，以達(dá)到建模后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總攝食時(shí)間變化量明顯，且適應(yīng)期后總攝食時(shí)間與大部分相關(guān)研究相似(≥200 s/10 min)。EOI模型與既往研究中神經(jīng)病理性疼痛與急性炎性痛模型相比，可能具有疼痛癥狀較輕、動(dòng)物自發(fā)性行為更少的特點(diǎn)，因此更長(zhǎng)的禁食時(shí)長(zhǎng)與較強(qiáng)的機(jī)械刺激更適用。

自我賞罰實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从掣呒?jí)中樞對(duì)疼痛的整合，實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作方便，實(shí)驗(yàn)大鼠在適應(yīng)期訓(xùn)練結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)人員每次測(cè)試僅需安裝操作儀器，并不需對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠反復(fù)操作，能夠減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物恐懼、緊張等心理，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，不同模型對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠的攝食水平穩(wěn)定。但是，自我賞罰實(shí)驗(yàn)也存在一些缺點(diǎn)，如實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，適應(yīng)期訓(xùn)練需要2～3周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在訓(xùn)練失敗的可能，實(shí)驗(yàn)前需對(duì)大鼠禁食。

本研究評(píng)價(jià)了禁食對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響，以往關(guān)于EOI模型與pIONX模型的研究顯示建模并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)[17-18]，因此，本研究?jī)H探索自我賞罰實(shí)驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量影響。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，自我賞罰實(shí)驗(yàn)大鼠與空白對(duì)照大鼠相比，體質(zhì)量增長(zhǎng)較慢，測(cè)試第21天兩組體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)期間斷性禁食影響大鼠生長(zhǎng)。后續(xù)研究中，隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，測(cè)試時(shí)間點(diǎn)間隔應(yīng)延長(zhǎng)，尤其在長(zhǎng)期慢性痛研究中，需要注意禁食時(shí)間與禁食時(shí)長(zhǎng)的選擇。

3.3 兩種行為學(xué)方法評(píng)估pIONX與EOI兩種模型的疼痛特點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pIONX模型與EOI模型大鼠在建模后von Frey纖維機(jī)械誘發(fā)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與自我賞罰實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)出不同的時(shí)程特點(diǎn)。

pIONX模型建模后，機(jī)械刺激誘發(fā)疼痛在建模后1 d開(kāi)始出現(xiàn)，持續(xù)到測(cè)試末，而自我賞罰行為學(xué)表現(xiàn)則在建模1周后下降。自我賞罰實(shí)驗(yàn)疼痛行為的出現(xiàn)晚于機(jī)械刺激誘發(fā)的疼痛行為，原因可能為手術(shù)導(dǎo)致的急性神經(jīng)損傷后，損傷神經(jīng)周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)異位神經(jīng)斷端的異常興奮，并對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞因子等反應(yīng)增強(qiáng)，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)機(jī)械刺激的躲避行為[32-33]，但并不影響自我賞罰實(shí)驗(yàn)行為表現(xiàn)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，疼痛逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁裕霈F(xiàn)了中樞敏化，神經(jīng)病理性疼痛表現(xiàn)出神經(jīng)損傷后持續(xù)的異常輸入引發(fā)的脊髓背角神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)、腹后丘腦脊髓背角廣動(dòng)力范圍神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)、前扣帶回星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)等[18,33-34]，此時(shí)，自我賞罰實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)表現(xiàn)即總的攝食時(shí)長(zhǎng)開(kāi)始減少。

EOI模型建模后，機(jī)械刺激誘發(fā)的疼痛在建模后7 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，持續(xù)到測(cè)試末，而自我賞罰實(shí)驗(yàn)的疼痛出現(xiàn)早于機(jī)械刺激誘發(fā)的疼痛，提示0.4 mm咬合干擾會(huì)直接刺激大鼠口腔內(nèi)多種感受器，給實(shí)驗(yàn)大鼠帶來(lái)的不適感更強(qiáng)，自我賞罰實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)得更早。既往研究也顯示，長(zhǎng)期EOI模型存在外周與中樞敏化機(jī)制，隨咬合干擾時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)中樞敏化，表現(xiàn)為長(zhǎng)期咬合干擾后三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核神經(jīng)元反應(yīng)高度活躍、膠質(zhì)細(xì)胞活化、前扣帶回突觸傳導(dǎo)增強(qiáng)等，另外海馬的記憶功能也參與相關(guān)機(jī)制[28-29,35]。中樞敏化也表現(xiàn)為痛敏感受野擴(kuò)大，出現(xiàn)觸須墊機(jī)械反應(yīng)閾值降低，因此，自我賞罰實(shí)驗(yàn)的疼痛感受出現(xiàn)早于觸須墊局部機(jī)械刺激誘發(fā)反應(yīng)的疼痛。

上述結(jié)果也提示，對(duì)于機(jī)械刺激誘發(fā)的疼痛出現(xiàn)晚于自我賞罰實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的模型(如EOI模型)，自我賞罰實(shí)驗(yàn)可應(yīng)用于觀(guān)察建模后早期的疼痛表現(xiàn)，對(duì)研究這一階段的口頜面疼痛機(jī)制有重要意義。實(shí)驗(yàn)中，兩種模型總攝食次數(shù)與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組內(nèi)差異大，這與既往大部分研究相同，反映出不同實(shí)驗(yàn)大鼠個(gè)體間的攝食習(xí)慣差異[8-10]。

綜上，自我賞罰實(shí)驗(yàn)可以作為咬合干擾致口頜面疼痛的行為學(xué)測(cè)定新方法，在神經(jīng)病理性疼痛和咬合干擾所致口頜面疼痛的模型中均可穩(wěn)定應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)兩種模型中，自我賞罰實(shí)驗(yàn)與機(jī)械刺激誘發(fā)反應(yīng)均表現(xiàn)出了不同的痛敏時(shí)程，兩種方法互為補(bǔ)充可以更全面地揭示不同模型的疼痛行為學(xué)特點(diǎn)，在未來(lái)研究中應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)研究的需要選擇合適的行為學(xué)方法，以更好地探索口頜面疼痛的相關(guān)機(jī)制。