劉春麗， 張潔， 郭霞， 梁媛， 張圣林

承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 1耳鼻喉科, 2腫瘤科(河北承德 067000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的發(fā)生與愛潑斯坦-巴爾病毒(epstein-barr virus，EBV)感染密切相關[1-2]，EBV主要通過癌蛋白潛伏膜蛋白1(LMP1)的表達促成腫瘤的發(fā)生。通過對多種腫瘤進行的大規(guī)模的miRNA篩選顯示，LMP1可以調節(jié)miRNA的表達模式，如下調miR-203、miR-29b，上調miR-155、miR-21、miR-10b，從而對細胞遷移、增殖、凋亡產生多效作用[3]。體外實驗證明LMP1通過Twist1上調了鼻咽癌細胞系C666.1中miR-10b的表達，增強了移動性并促進體外遷移和侵襲以及體內攜帶腫瘤裸鼠的死亡[4]。鼻咽癌患者活檢組織標本中miR-10b是否通過LMP1、Twist1調控及其與鼻咽癌增殖與遷移的關系并沒有報道。本研究通過檢測鼻咽癌活檢組織中miR-10b、LMP1、Twist1的表達情況，探討三者的相關性。通過檢測內皮細胞和基質細胞標記物，評估m(xù)iR-10b在體內對鼻咽癌細胞發(fā)生和發(fā)展的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院2017年6月至2018年9 月進行治療的79例鼻咽癌患者，所有患者均經組織學檢查證實為原發(fā)性鼻咽癌，在手術前沒有接受過放療、化療或生物治療;沒有切除或轉移性疾病的病史;沒有患其他原發(fā)性腫瘤。所有患者均有完整的臨床資料。男48例，女31例；平均(46.23±2.55)歲，其中12個活檢組織標本是青年型(年齡<30歲的患者)。鼻咽癌的臨床分期按照美國癌癥聯(lián)合會/國際抗癌聯(lián)盟(AJCC/UICC)確定TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ期48例，Ⅳ期18例。有淋巴結轉移52例，無淋巴結轉移27例。組織學類型根據世界衛(wèi)生組織2005版確定組織切片，低分化或未分化鱗狀細胞癌63例，中/高分化鱗狀細胞癌16例。其中12個活檢組織標本是青年型(年齡<30歲的患者)。所有患者均已簽知情同意書。鼻咽癌的臨床分期按照美國癌癥聯(lián)合會/國際抗癌聯(lián)盟(AJCC/UICC)確定TNM分期，組織學類型根據世界衛(wèi)生組織2005版確定組織切片。另35個來自鼻咽的正?；顧z樣本用作對照。

1.2 實驗試劑 TRizol試劑:英杰生命技術有限公司提供; 一抗：抗E-鈣黏蛋白，抗β-連環(huán)蛋白，抗纖連蛋白，抗N-鈣黏蛋白，抗波形蛋白和抗MMP-9(目錄號分別為ab1416; ab22656; ab6328; ab18203；ab8978; ab58803)兔抗鼠多克隆二抗抗體(目錄號ab6728)均購自美國Abcam公司。

1.3 PCR檢測miR-10b的表達水平 按照試劑說明書的步驟，用TRizol試劑裂解組織，氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，取各組RNA，用紫外分光光度計測RNA濃度及OD260/260值，取OD260/280在1.8～2.0樣品進行反轉錄成cDNA, 于-80℃保存?zhèn)溆?。GAPDH作為內參對照。GAPDH引物序列：上游為5′-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′,下游為5′-CGCCCAATACGACCAAATCC-3′,產物長度122 bp，循環(huán)次數35次，退火溫度60℃。miR-10b引物序列：上游為5′-ACACTCCAGCTGGGTACCCTGTAGAA-3′，下游為5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′，產物長度65 bp，循環(huán)次數40次，退火溫度61℃。用2-ΔΔCt方法對組織樣本目的基因的相對表達量進行分析。

1.4 PCR檢測miR-10b與Twist1、LMP1表達水平 Twist1上游引物序列5′-CAAGCTGCAGCTATGTGGC-3′，下游引物序列5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGG-3′，產物長度298 bp，循環(huán)次數35次，退火溫度60℃。LMP1上游引物序列5′-ACACACTGCCCTGAGGATG -3′，下游引物序列5′-TGAGCAGGAGGGTGATCA-3′，產物長度298 bp，循環(huán)次數35次，退火溫度60℃。RNA提取方法和每個樣本的相對表達量分析同1.3。根據Twist1和LMP1的相對表達水平，將79例鼻咽癌患者分為3組，第一組(即組1)為Twist1陰性表達，與LMP1的表達譜無關的病例，共35例。第二組(即組2)為Twist1陽性表達和LMP1的陰性表達的病例，共19例。第3組(即組3)為Twist1和LMP1同時陽性表達的病例，共25例。用PCR檢測miR-10b 與Twist1、LMP1的表達水平，分析三者的相關性。

1.5 Western法檢測E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白、纖連蛋白、N-連環(huán)蛋白、波形蛋白和MMP-9水平 按照試劑盒說明書，用裂解液裂解各組的標本，BCA 法測定蛋白濃度，各樣品上樣量20 μg，在10%分離膠(恒壓120 V)和5%濃縮膠(恒壓80 V)中進行電泳，2 h后將凝膠上的蛋白濕轉法轉移至硝酸纖維素膜上。一抗(稀釋液濃度1∶1 500) 室溫下孵育膜1 h，常規(guī)洗滌。然后將膜與二抗(稀釋液濃度1∶2 500)一起溫育1 h，常規(guī)洗滌，顯影。使用全自動蛋白質印跡分析系統(tǒng)記錄免疫印跡結果。每個條帶的密度用凝膠成像分析系統(tǒng)確定，β-肌動蛋白作內參。計算目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 miR-10b在鼻咽癌活檢組織和鼻咽正常組織的表達水平 鼻咽癌活檢組織中miR-10b的相對表達水平是88.6±0.75，正常組織miR-10b的相對表達水平是3.56±0.46，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 miR-10b的表達水平與Twist1和LMP1的相關性分析 79個原發(fā)性鼻咽癌活組織樣本分別檢測到33例和46例Twist1和LMP1的陽性表達。在鼻咽正常組織樣本中, 所有35例患者的LMP1表達均為陰性，而僅在4例患者中檢測到Twist1。本研究發(fā)現(xiàn)Twist1和LMP1陽性病例與miR-10b過表達顯著相關(P<0.05)。如表1所示，同時表達LMP1和Twist1的病例(第3組)與只有Twist1陽性表達(第2組)和Twist1陰性表達(第1組)的病例相比較, miR-10b mRNA的相對表達水平更高,差異有統(tǒng)計學意義(組2和組3比較P=0.035，組1和組3比較P=0.013)。

2.3 上皮細胞和基質細胞標志物的表達水平 Western印跡分析法檢測鼻咽癌組織、鼻咽正常組織中上皮細胞和間質細胞標記物的表達水平。如表2所示，鼻咽癌組織中E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達水平顯著低于鼻咽正常組織(P<0.05)。鼻咽癌組織中纖連蛋白、N-連環(huán)蛋白、波形蛋白和MMP-9的表達水平高于沒有miR-10b表達的鼻咽正常組織(P<0.05)。

表1 分組后每組miR-10b的相對表達水平

注：*與組3比較P<0.05

表2 鼻咽癌組織和正常組織中上皮細胞標志物和間質細胞標志物的表達水平

注：*與正常組織比較P<0.05

3 討論

鼻咽癌是鼻咽黏膜的惡性腫瘤，伴有早期遠處轉移和局部侵襲，在我國的廣東、廣西發(fā)病率很高[5]。目前隨著診斷和治療方法的改進，大多數早期鼻咽癌患者已成功治愈。然而，大多數中晚期患者由于腫瘤細胞的侵襲和轉移5年生存率極低。資料顯示30%～40%的鼻咽癌患者會在4年內發(fā)生遠處轉移，轉移后預后變差，且易引起復發(fā)[6]。其原因是包括鼻咽癌細胞在內的癌細胞出現(xiàn)轉移后，促進了上皮-間質轉化(EMT)，以上皮標志物喪失-間充質標志物增多為特征，從而加速了遷移和侵襲[7-8]。

EMT是指上皮細胞轉化為間充質細胞，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和入侵能力的一種重要的生物學細胞過程。EMT后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞增多、增厚，表面纖維和偽足增加。上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達減少，而間充質細胞標志物纖維蛋白，N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達增加，增強了細胞遷移能力和腫瘤轉移的能力[9-10]。EMT后，處于靜止狀態(tài)的上皮細胞變?yōu)殚g充質細胞后即具有很強的遷移能力。此外，蛋白水解酶，如MMP-9，可以降解基底膜，進一步促進細胞侵入細胞外基質中。鼻咽癌細胞在EMT的過程中，這些細胞標記物有類似的變化，盡管導致這些變化的機制仍不清楚，但在轉移進展的早期階段起著關鍵作用。因此，更好地了解鼻咽癌轉移的分子模式，尋找有效的靶向治療，盡可能地減少腫瘤細胞的侵襲和轉移，對于開發(fā)有效的治療鼻咽癌的新策略，更好地治療中晚期鼻咽惡性腫瘤是至關重要的。

微小RNA(miRNA)是一種高度保守的單鏈小分子非編碼RNA，參與調節(jié)多種細胞途徑，除具有與細胞生長發(fā)展和分化相關的關鍵調節(jié)功能外，也充當癌基因或腫瘤抑制因子[11]。在鼻咽癌患者中，已觀察到失調的miRNA表達，并且發(fā)現(xiàn)特異性miRNA的異常表達與鼻咽癌細胞的轉移和侵襲相關。目前，發(fā)現(xiàn)了35種miRNA在鼻咽癌組織中的表達水平發(fā)生了變化，其中包括miR-10b[12]。

Horikawa等[13]在鼻咽癌細胞株的研究中發(fā)現(xiàn)， EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1在細胞培養(yǎng)模型中通過NF-κB途徑誘導轉錄調節(jié)因子Twist1的過表達，導致鼻咽癌的轉移，Li等[14]報道了miR-10b在C666-1 鼻咽癌細胞系中，EB病毒陽性的潛伏膜蛋白-1(LMP1)表達誘導Twist1表達高水平的miR-10b，miR-10b的上調又增加了細胞的移動性，但在LMP1沉默的C666.1細胞中如果誘導miR-10b過表達，也可以明顯促進體外傷口愈合和跨膜侵襲以及體內攜帶腫瘤裸鼠的死亡[15]。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-10b在體外可促進鼻咽癌的轉移。但在鼻咽癌患者體內miR-10b是否也可以通過LMP1及Twist1促進癌組織的生長與擴散并無報道。

本研究通過檢測鼻咽癌患者鼻咽組織及正常人鼻咽組織發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者鼻咽組織中miR-10b高表達，明顯高于正常組，且miR-10b在組3(Twist1和LMP1同時陽性)的表達明顯高于單陽性組2(Twist1陽性LMP1陰性)或陰性組1(Twist1陰性)(分別為P=0.035，P=0.013)。即表達/或不表達Twist1與同時表達LMP1和Twist1的樣品miR-10b具有顯著的區(qū)別。結果表明LMP1促成miR-10b的過表達，與鼻咽癌細胞系的研究[15]結果一致。研究還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達低于正常鼻咽上皮組織，而基質細胞標志物纖連蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和MMP-9的表達明顯高于鼻咽上皮組織。上皮細胞標志物的減少，可以減弱細胞-細胞黏附，從而減少細胞黏附和增加細胞基底膜運動。而基質細胞標志物的增加，可以增強癌細胞的遷移能力，從而促進鼻咽癌細胞的EMT，促進腫瘤細胞的侵襲和凋亡[16]。已知轉錄因子KLF4是miR-10b的直接靶點，miR-10b可通過靶向轉錄因子KLF4來調節(jié)EMT[17]，結果說明在鼻咽癌患者體內過表達的miR-10b促進了癌細胞的EMT。

總之，鼻咽癌活檢組織標本中高水平的LMP1和Twist1的同時表達可以誘導miR-10b高表達，即LMP1通過轉錄因子Twist1上調miR-10b的水平。miR-10b的升高可以使上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達下降，使細胞-細胞黏附能力減弱，增加細胞運動；基質細胞標志物纖連蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和MMP-9增加，細胞遷移能力增強，來促進鼻咽癌細胞的EMT，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。本研究為miR-10b作為治療鼻咽癌的關鍵靶點，為開發(fā)新的靶向治療提供實驗基礎。但其確切機制還需進一步研究。