鄒榮 胡韜韜 余秉治

430022 武漢，武漢市第一醫(yī)院腎內(nèi)科

新月體腎炎是腎臟病領(lǐng)域常見(jiàn)的急危重癥，其病理核心為包曼囊內(nèi)超過(guò)50%腎小球新月體形成，且新月體占腎小球面積50%以上。新月體可分為細(xì)胞性、細(xì)胞纖維性和纖維性新月體，疾病早期以細(xì)胞性新月體形成為主[1]。一般認(rèn)為足細(xì)胞并不參與新月體形成，但近十年來(lái)臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示足細(xì)胞可能是啟動(dòng)新月體形成的主要細(xì)胞，本文就足細(xì)胞在新月體腎炎中的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

一、足細(xì)胞橋的發(fā)現(xiàn)

2001年，Le Hir等[2]研究抗腎小球基底膜腎炎小鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，造模成功的小鼠腎小球內(nèi)可見(jiàn)彌漫毛細(xì)血管內(nèi)炎癥、新月體形成和足細(xì)胞足突廣泛融合。最值得注意的是，在腎小球毛細(xì)血管襻和壁層上皮細(xì)胞間可以看到橋接細(xì)胞，該細(xì)胞與壁層上皮細(xì)胞互相接觸，并破壞了壁層上皮細(xì)胞之間的緊密連接。橋接細(xì)胞存在于新月體形成的早期和發(fā)展階段，并在細(xì)胞新月體后期向纖維新月體轉(zhuǎn)變的過(guò)程中也能觀察到。電鏡觀察到新月體腎炎模型中足細(xì)胞膜形成片狀突起，逐漸遷移、黏附鮑曼囊，插入壁層上皮細(xì)胞緊密連接之間，在腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)和壁層基底膜(parietal basement membrane，PBM)之間形成足細(xì)胞橋(podocyte bridge)[2]。通過(guò)免疫染色證實(shí)這些細(xì)胞表達(dá)了足細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白如腎母細(xì)胞瘤蛋白1(wilms tumor protein1，WT1)，整合素α3亞單位，podocin，synaptopodin和CD2AP，提示它們可能起源于足細(xì)胞。

但也有不同意見(jiàn)提出新月體細(xì)胞染色未發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞特異蛋白的表達(dá)，認(rèn)為新月體中增殖細(xì)胞可能主要來(lái)源于壁層上皮細(xì)胞，因此，對(duì)足細(xì)胞參與新月體形成提出質(zhì)疑。

2004年Moeller等[3]首次報(bào)道將足細(xì)胞特異性2.5P-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSA26報(bào)告小鼠雜交，通過(guò)足細(xì)胞特異性標(biāo)記觀察到在新月體形成早期即有足細(xì)胞遷移并粘附鮑曼囊；病理細(xì)胞計(jì)數(shù)提示新月體細(xì)胞中大約有50%細(xì)胞來(lái)源于足細(xì)胞；從而證實(shí)了足細(xì)胞是參與新月體形成的重要細(xì)胞。2016年Succar及其同事利用透射電鏡技術(shù)再次證實(shí)了足細(xì)胞橋的形成。他們使用腎毒血清(nephrotoxic serum，NTS)誘導(dǎo)建立新月體腎炎小鼠模型，分別在造模結(jié)束后第1、2、3、5、7、14天通過(guò)透射電鏡觀察腎小球變化。第1天相鄰足細(xì)胞的胞體之間廣泛形成了接觸，并且在胞體接觸部位出現(xiàn)緊密連接。免疫熒光可以檢測(cè)到緊密連接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)表達(dá)增加。第2天，足細(xì)胞之間距離減少，腎小球基底膜厚度增加。第3天足細(xì)胞足突融合(foot process effacement，F(xiàn)PE)，第5天足突廣泛融合，并在毛細(xì)血管襻和鮑曼囊之間可以觀察到足細(xì)胞橋形成。在第7天和第14天，所有腎小球中都出現(xiàn)了纖維素樣壞死和細(xì)胞新月體形成[4]。因此有人提出，足細(xì)胞橋的出現(xiàn)可能是新月體形成的關(guān)鍵起始事件。

二、足細(xì)胞遷移與新月體形成

正常腎小球中的足細(xì)胞是高度分化成熟的細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)成熟足細(xì)胞的標(biāo)記蛋白如足細(xì)胞骨架蛋白、裂孔隔膜蛋白復(fù)合體、頂膜區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白、基底區(qū)連接膜蛋白，一般不具有遷移能力[5]。但足細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中或病理?yè)p傷之后，足突會(huì)形成偽足樣結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有的表現(xiàn)為寬膜突起，被稱(chēng)為板狀偽足，有的表現(xiàn)為長(zhǎng)而細(xì)的尖銳結(jié)構(gòu)，被稱(chēng)為絲狀偽足。足細(xì)胞通過(guò)足突骨架蛋白的收縮將偽足向前推進(jìn)延伸。足細(xì)胞底部的粘著斑復(fù)合物原本將足突固定在腎小球基底膜上，在病理?yè)p傷后參與足細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。足細(xì)胞每次運(yùn)動(dòng)都涉及到足突與基底膜粘著點(diǎn)的破壞與重建，并在絲狀偽足向前移動(dòng)時(shí)錨定到新的位置。這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為足細(xì)胞的遷移[6]。足細(xì)胞遷移能力的獲得是足細(xì)胞成為橋接細(xì)胞、啟動(dòng)新月體形成的前提條件。

研究證實(shí)，許多足細(xì)胞成熟標(biāo)記蛋白的表達(dá)或功能異常參與并調(diào)控足細(xì)胞遷移。Rho-GTPases是調(diào)節(jié)足細(xì)胞骨架蛋白、調(diào)控足細(xì)胞遷移的重要蛋白家族。Rho(Ras homologous)家族的小GTPases屬于Ras超家族，分子量20 000～30 000，存在于所有真核細(xì)胞生物中，通過(guò)影響細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重建、細(xì)胞和細(xì)胞之間、細(xì)胞和基質(zhì)之間的粘附來(lái)作為分子開(kāi)關(guān)在細(xì)胞遷移中發(fā)揮核心作用。Cdc42、Rac1和RhoA是Rho-GTPases家族的主要成員。RhoA定位于人染色體3p21.3區(qū)域，基因全長(zhǎng)53 kDa，通過(guò)促進(jìn)胞體及肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白應(yīng)力纖維的形成，調(diào)節(jié)收縮性肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白微絲的聚合，維持足細(xì)胞細(xì)胞骨架的穩(wěn)定，其在成纖維細(xì)胞中可誘導(dǎo)黏著斑和應(yīng)力纖維的生成。應(yīng)用活化的RhoA轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞遷移[7]。Rac調(diào)節(jié)層狀偽足的形成和皺褶，還可與TRPC6形成復(fù)合物，由TRPC6介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，可升高Rac活性，促使足細(xì)胞遷移。Cdc42主要參與調(diào)節(jié)絲狀偽足的形成，從而調(diào)節(jié)足細(xì)胞的遷移行為[8]。

Synaptopodin屬于足細(xì)胞骨架蛋白，分子量100 kDa，是一種富含脯氨酸的肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，僅表達(dá)于成熟分化的足細(xì)胞。已有研究證實(shí)，Synaptopodin能夠從多個(gè)方面影響足細(xì)胞遷移行為。 Synaptopodin能夠與肌動(dòng)蛋白成束蛋白α-actinin-4連結(jié)而調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白成束功能，影響 F-actin 的聚集和解聚，從而調(diào)節(jié)足細(xì)胞的“可塑性”[9]；Synaptopodin通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性阻斷Smurf1介導(dǎo)的RhoA泛素化降解，從而誘導(dǎo)應(yīng)力纖維的形成[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)，synaptopodin直接與接頭蛋白IRSp53相連接，通過(guò)Cdc42-IRSp53-Mena復(fù)合物抑制足細(xì)胞絲狀偽足的形成，維持足細(xì)胞在基底膜上的錨定狀態(tài)。Synaptopodin基因缺失的小鼠表現(xiàn)出腎臟足細(xì)胞壓力絲缺失，形成異常非極性的層狀偽足，阻止細(xì)胞遷移[11]。

Podocin、Nephrin和CD2相關(guān)蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)是目前已經(jīng)確定的三種裂孔隔膜蛋白，三種蛋白相互作用，共同形成裂孔隔膜蛋白復(fù)合體，穩(wěn)定裂孔隔膜完整性[5]。CD2AP 作為重要的胞內(nèi)接頭蛋白，不僅與nephrin和podocin直接作用，而且可直接與纖絲狀肌動(dòng)蛋白連接以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組成和排列[12]。 Podocin分子量42 kDa，NPHS2基因編碼，由383個(gè)氨基酸殘基組成。其結(jié)構(gòu)呈發(fā)卡樣，定位于裂孔隔膜的脂類(lèi)微功能域，通過(guò)瞬時(shí)受體電位通道蛋白6(transient receptor potential channel 6，TRPC6)的集聚發(fā)揮機(jī)械感受器的作用。當(dāng)足細(xì)胞受到機(jī)械性刺激時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞骨架蛋白的重排和足突收縮。裂孔隔膜結(jié)構(gòu)分子的異?？梢砸鹱慵?xì)胞骨架的重排，并推測(cè)可能進(jìn)一步影響足細(xì)胞遷移能力的獲得，但它們?cè)谧慵?xì)胞遷移中的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究和證實(shí)[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)信號(hào)通路活化也參與了足細(xì)胞遷移。哺乳動(dòng)物Notch信號(hào)通路由四種受體(Notch1、Notch 2、Notch3和Notch 4)，五種配體(DLL 1、DLL 3、DLL 4、Jagged 1和Jagged 2)構(gòu)成。Notch信號(hào)通路調(diào)控幾乎涉及所有細(xì)胞的增殖和分化活動(dòng)，其調(diào)控過(guò)程可概括為：配體與Notch受體胞外區(qū)域結(jié)合—Notch胞內(nèi)胞外段分離—可溶性活性Notch受體胞內(nèi)區(qū)(NICD)進(jìn)入細(xì)胞核—形成CLS—ICN復(fù)合體—激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄[14]。腎毒血清能誘導(dǎo)正常小鼠足細(xì)胞上調(diào)Notch3受體及其靶基因HeyL表達(dá)；通過(guò)基因工程技術(shù)在足細(xì)胞過(guò)表達(dá)Notch3活化細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，觀察到足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，表現(xiàn)出遷移特性。在體內(nèi)抑制Notch3表達(dá)能有效抑制腎內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集和新月體形成[15]。

表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)及其下游信號(hào)通路激活也參與足細(xì)胞遷移。 Bollee等[16]在腎毒血清誘導(dǎo)的新月體腎炎模型中觀察到EGF介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號(hào)通路活化。該信號(hào)通路激活能誘導(dǎo)足細(xì)胞環(huán)狀F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)(RiLiS)形成，而RiLiS結(jié)構(gòu)是足細(xì)胞頂端突起和頂端遷移能力獲得的標(biāo)志性改變。

雖然體內(nèi)足細(xì)胞是高度分化的成熟細(xì)胞，一般情況下不具有遷移能力，但在新月體腎炎模型中多次觀察到足細(xì)胞失去正常極性并成為具有遷移能力的細(xì)胞，說(shuō)明足細(xì)胞遷移能力的獲得可能是足細(xì)胞橋和新月體形成的基礎(chǔ)條件。

三、足細(xì)胞增殖與新月體形成

Reidy等[17]認(rèn)為，足細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化時(shí)將失去成熟足細(xì)胞原有的蛋白標(biāo)記分子，如Nephrin、synaptopodin等，轉(zhuǎn)而表達(dá)上調(diào)的間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物，如成纖維細(xì)胞特殊蛋白Ⅰ、整合素連接激酶、纖維連接蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶 9等。已經(jīng)證實(shí)高糖和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)足細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化[18]，美國(guó)匹茲堡大學(xué) Liu等[19]利用TGF-β刺激體外培養(yǎng)的足細(xì)胞，足細(xì)胞原有標(biāo)記蛋白如 Nephrin、P-cadherin、ZO-1等減少，轉(zhuǎn)而表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞蛋白分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶9、結(jié)蛋白等，進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞功能紊亂，濾過(guò)膜完整性喪失。在新月體腎炎患者的腎活檢標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)成熟足細(xì)胞丟失[20]、足細(xì)胞表型改變[21]和足細(xì)胞來(lái)源的新月體細(xì)胞高表達(dá)增殖蛋白如增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和Ki67[22]，提示足細(xì)胞可能在新月體形成過(guò)程中發(fā)生了由高度分化的成熟細(xì)胞表型向具有增殖能力的表型轉(zhuǎn)化。正常情況下，巢蛋白Nestin僅表達(dá)在成熟足細(xì)胞胞漿及初級(jí)足突。Thorner等[23]觀察35例腎活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)新月體中增殖細(xì)胞也表達(dá)巢蛋白Nestin，并且在腎小球毛細(xì)血管襻和壁層上皮細(xì)胞之間可以觀察到巢蛋白陽(yáng)性的橋接細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)了新月體形成過(guò)程中足細(xì)胞增殖的存在。

多數(shù)腎病類(lèi)型的病理進(jìn)展中，足細(xì)胞數(shù)目不斷減少。但部分類(lèi)型腎病，如細(xì)胞型局灶節(jié)段性腎小球硬化、塌陷型腎小球病和人類(lèi)免疫缺陷病毒相關(guān)性腎病卻出現(xiàn)了足細(xì)胞增殖的情況[18]。足細(xì)胞增殖也見(jiàn)于新月體腎炎病理?yè)p傷。選擇性刪除足細(xì)胞中von Hippel Lindau(Vhlh)基因，穩(wěn)定了缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)α亞基，隨后上調(diào)HIF靶基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A、趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)及其配體的表達(dá)。Vhlh突變小鼠發(fā)育4周時(shí)發(fā)生腎小球性血尿和蛋白尿，腎臟病理顯示新月體形成和足細(xì)胞增殖。該病理過(guò)程與足細(xì)胞HIF靶基因CXCR4特異性表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，誘導(dǎo)CXCR4變異足以引起足細(xì)胞增殖和新月體形成。給予抗CXCR4抗體能有效改善Vhlh突變小鼠新月體腎炎的嚴(yán)重程度[24]。該研究提示受損的去分化足細(xì)胞增殖可能是為了彌補(bǔ)缺失的正常足細(xì)胞，而增殖的足細(xì)胞在鮑曼囊內(nèi)堆積，又參與新月體形成。

Dai及其同事也觀察到新月體腎炎中足細(xì)胞增殖的存在，并證明足細(xì)胞增殖與信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)的激活有關(guān)[25]。STAT是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，被各種胞外細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)激活后進(jìn)入胞核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子序列的特定位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄[26]。在NTS誘導(dǎo)的新月體腎炎模型中，足細(xì)胞STAT3的激活及其下游靶基因表達(dá)增加。通過(guò)基因工程技術(shù)誘導(dǎo)足細(xì)胞特異性缺失STAT3，觀察到STAT3缺失減輕了NTS誘導(dǎo)的新月體形成和腎臟損傷。STAT3缺失可通過(guò)阻止壁層上皮細(xì)胞募集和下調(diào)足細(xì)胞分化標(biāo)志物、抑制足細(xì)胞增殖來(lái)減少新月體的形成。該研究提示足細(xì)胞STAT3的激活對(duì)于新月體腎小球腎炎的發(fā)展至關(guān)重要，推測(cè)IL-6和EGF可能由內(nèi)在的腎小球細(xì)胞(足細(xì)胞，腎小球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)和募集到腎小球的循環(huán)免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)產(chǎn)生。然后，IL-6和EGF在受損腎小球中的局部蓄積可以激活足細(xì)胞中的JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)，并啟動(dòng)足細(xì)胞增殖，足細(xì)胞標(biāo)記物的丟失和壁層上皮細(xì)胞的募集，最終導(dǎo)致新月體形成[25]。細(xì)胞增殖由所處的細(xì)胞周期決定，而細(xì)胞周期受細(xì)胞周期蛋白cyclin的調(diào)控。不同時(shí)相的cyclin激活特定的細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)而引起細(xì)胞增殖。cyclin-CDK復(fù)合物受CDK抑制蛋白(CDK-inhibitor，CDKI)P21、P27和P57調(diào)控。大多數(shù)腎小球疾病時(shí)足細(xì)胞難以增殖的原因是CDKI表達(dá)沒(méi)有削弱反而得到了加強(qiáng)。然而部分病理類(lèi)型的足細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控失衡導(dǎo)致足細(xì)胞增殖。Shankland等[27]研究發(fā)現(xiàn)，不同腎病類(lèi)型CDKI表達(dá)不同，在微小病變和膜性腎病組，P21、P27和P57表達(dá)與正常腎臟無(wú)明顯差異，但在細(xì)胞型局灶節(jié)段性腎小球硬化、塌陷型腎小球病和HIVAN組，足細(xì)胞P27和P57表達(dá)受抑制，激活了與有絲分裂相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白，從而促使足細(xì)胞發(fā)生增殖[28]。在新月體腎炎患者腎組織中也觀察到細(xì)胞周期蛋白cyclin A和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)表達(dá)上調(diào)，CDK抑制蛋白p27表達(dá)減弱[29]。該現(xiàn)象提示細(xì)胞周期蛋白參與了新月體腎炎的病生過(guò)程。但足細(xì)胞是否發(fā)生細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)失衡，細(xì)胞表型變化是否與細(xì)胞周期蛋白有關(guān)，仍需要進(jìn)一步深入研究。

抑制足細(xì)胞增殖也可以減輕新月體腎炎中腎組織損傷。腎毒血清誘導(dǎo)的新月體腎炎小鼠模型中觀察到microRNA-92a表達(dá)上調(diào)，并抑制p57kip2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)足細(xì)胞經(jīng)歷分化表型的失調(diào)和增殖。給予抗miR-92a抗體可以防治小鼠白蛋白尿和腎功能衰竭，表明miR-92a抑制可以作為RPGN的潛在治療策略[30]。同樣，在NTS誘導(dǎo)的新月體腎炎小鼠模型中，Dai等[31]觀察到維甲酸(retinoic acid，RA)通過(guò)激活RA受體α(retinoic acid receptor alpha，RARα)抑制足細(xì)胞增殖，恢復(fù)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)，RA治療能顯著減輕足細(xì)胞損傷，改善腎功能并減少小鼠的新月體數(shù)量，敲除RARα，RA的保護(hù)作用在新月體腎炎模型小鼠中不再呈現(xiàn)。

有證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ，PPARγ)的表達(dá)可以預(yù)防足細(xì)胞損傷。腎毒血清誘導(dǎo)的新月體腎炎小鼠模型中足細(xì)胞PPARγ表達(dá)豐度和轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)的治療能夠提高足細(xì)胞對(duì)損傷的耐受性，有效減輕新月體的形成和腎臟損害。該研究提示PPARγ途徑可能是新月體腎炎的治療靶標(biāo)之一[32]。對(duì)這些研究結(jié)果的綜合解釋是在各種致病因素的作用下，足細(xì)胞可能失去他們分化成熟的細(xì)胞標(biāo)記，向增殖細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化并獲得遷移能力；足細(xì)胞橋形成以后，足細(xì)胞與壁層上皮細(xì)胞相互接觸，相互影響，誘導(dǎo)足細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等大量增殖，并釋放炎癥因子，從而推動(dòng)新月體形成的病理進(jìn)程[33]。

四、小結(jié)

細(xì)胞新月體的起源一直存在爭(zhēng)議。早期理論在發(fā)病機(jī)制中低估了足細(xì)胞的作用，但新近研究表明，足細(xì)胞是新月體形成的重要細(xì)胞，廣泛參與了新月體腎炎的發(fā)生與進(jìn)展，針對(duì)足細(xì)胞的治療策略有可能抑制新月體腎炎的進(jìn)展和惡化。