段超勤 閔 寒 鄒曉平 陳志榮

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院東區(qū)消化科1(215001)

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科2

背景：蓽茇酰胺(PL)是提取自中藥蓽茇的一種生物堿類化合物，許多研究表明，PL在體內(nèi)、體外對多種腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。目的：探討PL對胃癌細(xì)胞TERT表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。方法：分別以不同濃度PL、AG490處理胃癌細(xì)胞，CCK-8和平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞活性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TERT mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測TERT、STAT3、p-STAT3、DNMT1蛋白表達(dá)，TRAP-ELISA法檢測端粒酶活性，螢光素酶報(bào)告基因檢測TERT基因啟動子活性。結(jié)果：與對照組相比，PL組胃癌細(xì)胞活性明顯下降，集落形成能力明顯降低，TERT mRNA和蛋白表達(dá)、端粒酶活性明顯下降，p-STAT3和DNMT1蛋白表達(dá)下降。AG490可明顯抑制胃癌細(xì)胞活性以及p-STAT3、DNMT1、TERT蛋白表達(dá)。結(jié)論：PL可顯著抑制胃癌細(xì)胞生長，其機(jī)制可能是通過STAT3介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控TERT表達(dá)，有望成為治療胃癌新的靶點(diǎn)藥物。

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全球每年約有100萬例新發(fā)胃癌病例和80萬例胃癌相關(guān)死亡病例，是全球第五大最常診斷的癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]。在我國，胃癌的總發(fā)病率和死亡率在各種惡性腫瘤中分別位居第二和第三位，且呈上升的趨勢[2]。近年來，隨著免疫治療、分子靶向藥物、新輔助化療等治療方法的不斷進(jìn)步和完善，胃癌治療策略有所改善，胃癌患者的總體生存率有所提高，但進(jìn)展期胃癌患者的預(yù)后仍不理想，5年生存率低于40%[3]?；熑允沁M(jìn)展期胃癌患者最主要的治療方法，但具有不良反應(yīng)多、患者耐受性差、有效率低、并發(fā)癥多等諸多問題[4]。因此，開發(fā)新的藥物以改善進(jìn)展期胃癌患者的生存預(yù)后是亟需解決的臨床問題。蓽茇酰胺(piperlongumine, PL)是從胡椒屬植物蓽茇中分離出來的一種天然植物堿，在體內(nèi)外可有效地抗腫瘤細(xì)胞毒性[5]。本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)PL對胃癌細(xì)胞的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)具有明顯的抑制作用[6]，但具體的調(diào)控機(jī)制不詳[7]。本研究通過檢測PL處理過的胃癌細(xì)胞中TERT、STAT3、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達(dá)，旨在探討PL調(diào)控胃癌細(xì)胞TERT表達(dá)的機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑

人胃癌細(xì)胞株AGS、HGC27購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，由南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室凍存保管。TERT螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科友情提供，PL(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，酪氨酸激酶抑制劑AG490(Selleck Chemicals)，CCK-8細(xì)胞增殖/細(xì)胞毒性檢測試劑盒[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]，TERT、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)抗體、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)抗體、DNMT1抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)，羊抗鼠、羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology, Inc.)，端粒酶活性檢測試劑盒(美國Millipore)，Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：將胃癌AGS和HGC27細(xì)胞以含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，常規(guī)消化傳代培養(yǎng)。

2. 細(xì)胞處理：取對數(shù)生長期AGS和HGC27細(xì)胞，按后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求以5×103/孔接種于96孔板(細(xì)胞活性檢測)，或以1 000/孔細(xì)胞接種于6孔板,12 h細(xì)胞貼壁后加入終濃度為0、5、7.5、10 μmol/L PL，每2～3天更換培養(yǎng)基1次(集落形成實(shí)驗(yàn))，或以2×105/孔接種于6孔板(除細(xì)胞活性和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)外的其余檢測)，孵育24 h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理。具體分組處理方式包括：①加入終濃度為0、7.5、10 μmol/L PL，孵育24 h；②加入終濃度為7.5 μmol/L PL，孵育12 h、24 h、36 h、48 h、60 h；③加入7.5 μmol/L PL孵育24 h，并設(shè)置不予任何處理的對照組；④將100 μmol/L AG490加入HGC27細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。

3. 細(xì)胞活性檢測(CCK-8法)：AGS和HGC27細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，棄培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基避光孵育1.5 h，以酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(A)值。細(xì)胞相對存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

4. 集落形成實(shí)驗(yàn)：于6孔板中每孔接種1 000個(gè)胃癌細(xì)胞，過夜使其貼壁生長后，加入0、5、7.5、10 μmol/L PL培養(yǎng)14 d。待細(xì)胞長成肉眼可見的集落后，2 mL甲醇固定15 min，行0.5%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)每組集落形成個(gè)數(shù)。

5. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：不同濃度PL處理AGS和HGC27細(xì)胞后，以Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。TERT引物上游：5’-GCG TTT GGT GGA TGA TTT CT-3’，下游：5’-CAG GGC CTC GTC TTC TAC AG-3’；內(nèi)參β-actin引物上游：5’-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3’，下游：5’-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)情況。

6. 蛋白質(zhì)印跡法：AGS和HGC27細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，胰酶消化、收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入適當(dāng)裂解液4 ℃或冰上裂解15 min，12 000 r/min離心15 min，BCA法蛋白定量，將各組蛋白調(diào)整為同一濃度，沸水煮5 min。取20～40 μg總蛋白上樣，8%～12% SDS-PAGE電泳分離1～2 h；蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h；加入1∶1 000～1∶2 000稀釋的相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次；加入相應(yīng)二抗孵育2 h，TBST洗滌3次；ECL顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)捕獲并保存圖像。

7. 端粒酶活性檢測：采用TRAP-ELISA法檢測端粒酶活性，以7.5 μmol/L PL處理HGC27細(xì)胞，分別在不同時(shí)間點(diǎn)按試劑說明書步驟進(jìn)行細(xì)胞收集、處理，檢測630 nm波長處的相應(yīng)A值。

8. 啟動子螢光素酶報(bào)告基因檢測：待接種于6孔板的細(xì)胞密度生長至60%～70%時(shí)，將pGL3-SV40(陽性對照質(zhì)粒)、pGL3-3778和pGL3-2089報(bào)告基因載體質(zhì)粒(將TERT啟動子近端的3778bp和2089bp片段亞克隆至pGL3載體構(gòu)建而成)，以脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物形式加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行，24 h后更換培養(yǎng)基，加入7.5 μmol/L PL再培養(yǎng)24 h，收集并處理細(xì)胞后用雙螢光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行檢測分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PL抑制AGS和HGC27細(xì)胞增殖

以0、5、7.5、10 μmol/L PL處理AGS和HGC27細(xì)胞24 h后，CCK-8法檢測結(jié)果顯示，PL可抑制兩株胃癌細(xì)胞增殖，且抑制作用呈劑量依賴性(圖1A)。以相應(yīng)濃度PL處理兩株細(xì)胞2周，腫瘤細(xì)胞集落形成能力明顯下降(圖1B)。

*P<0.05, **P<0.01

二、PL抑制胃癌細(xì)胞TERT基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，PL可顯著降低AGS和HGC27細(xì)胞TERT mRNA和蛋白表達(dá)，且作用呈劑量依賴性(圖2A-2B)。

1 Da=0.992 1 u

三、PL抑制胃癌細(xì)胞端粒酶活性

TRAP-ELISA法結(jié)果顯示，7.5 μmol/L PL可呈時(shí)間依賴性地降低細(xì)胞端粒酶活性，與抑制HGC27細(xì)胞生長的趨勢相一致(圖3A-3B)。

*P<0.05, **P<0.01

四、PL通過STAT3介導(dǎo)甲基化抑制TERT表達(dá)

與對照組相比，7.5 μmol/L PL對TERT啟動子螢光素酶活性無明顯抑制作用(圖4A)。

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，PL可明顯抑制p-STAT3和DNMT1表達(dá)，且呈劑量依賴性(圖4B)。給予AG490處理HGC27細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活性受到顯著抑制(圖4C)，p-STAT3、DNMT1、TERT蛋白表達(dá)明顯降低(圖4D)。

*P<0.05

討 論

近年來，諸多體內(nèi)、體外研究結(jié)果表明PL對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用，且未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用，其可能通過升高癌細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡、阻滯細(xì)胞周期[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，PL在體外對胃癌細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤作用，可抑制胃癌細(xì)胞活性、TERT mRNA和蛋白表達(dá)，并明顯抑制胃癌細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)。

TERT是端粒酶的催化成分，是端粒酶活性的限速因子，目前發(fā)現(xiàn)超過90%的癌癥中可見TERT表達(dá)，并在各種癌細(xì)胞的持續(xù)增殖中發(fā)揮重要作用[11]。目前認(rèn)為TERT是可能腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。有研究[12-14]顯示小干擾RNA敲減TERT后可抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可增強(qiáng)化療的敏感性?；谡{(diào)控端粒酶的腫瘤治療策略已成為數(shù)十年來的研究熱點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了一些潛在的端粒酶抑制劑如蘿卜硫素等，但由于該過程的復(fù)雜性，目前仍未研發(fā)出理想的抑制劑應(yīng)用于臨床[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PL對TERT具有明顯的抑制作用，有望成為新的TERT抑制劑。

表觀遺傳調(diào)控是指在不改變DNA序列的情況下發(fā)生的基因功能的可遺傳變化，主要調(diào)控方式包括DNA甲基化、組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、非編碼RNA調(diào)控等。表觀遺傳調(diào)控不僅在器官和個(gè)體發(fā)育中起重要作用，而且在許多疾病尤其是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用[16-17]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與抑癌基因啟動子甲基化密切相關(guān)，DNMT1可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和治療過程中起有重要作用[18-19]。本研究中，以PL處理后DNMT1表達(dá)下調(diào)，TERT表達(dá)相應(yīng)下調(diào)，提示PL可能通過DNMT1影響TERT表達(dá)。

有研究報(bào)道，在惡性T淋巴細(xì)胞中，STAT3通過與DNMT1基因啟動子中的STAT3 SIE/GAS結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控DNMT1的轉(zhuǎn)錄[20]。STAT3在不同腫瘤細(xì)胞株中均可調(diào)控TERT表達(dá)[21-22]。AG490是一種可特異性抑制JAK/STAT3信號通路的酪氨酸激酶抑制劑，在胃癌和膀胱癌細(xì)胞中具有明顯的抗腫瘤作用[23-24]。本研究以AG490處理胃癌HGC27細(xì)胞后，DNMT1和TERT表達(dá)均明顯下調(diào)，提示在胃癌細(xì)胞中JAK/STAT3信號通路可能參與了PL介導(dǎo)的DNMT1下調(diào)，從而抑制TERT表達(dá)。

總之，PL具有顯著的體外抗胃癌作用，其機(jī)制可能是通過JAK/STAT3途徑下調(diào)DNMT1，進(jìn)而抑制TERT表達(dá)。表觀遺傳調(diào)控在胃癌細(xì)胞PL-JAK/STAT3-DNMT1-TERT過程中起有重要作用，PL通過表觀遺傳調(diào)控影響TERT DNA甲基化，有望研發(fā)成為新的胃癌治療藥物。