馮帆，盧建遠(yuǎn)，黃堅(jiān)，湯承

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

犬腹瀉是寵物犬最為常見的疾病之一，細(xì)菌、寄生蟲和病毒是致犬腹瀉的三種主要病因。病毒性犬腹瀉是非免疫犬死亡的重要原因[1]，犬細(xì)小病毒2 型（CPV-2）、犬冠狀病毒（CCoV）和犬瘟熱病毒（CDV）是寵物犬中最常見的病毒性腸道病原體[2]。近年來(lái)的研究顯示，犬圓環(huán)病毒（CanineCV）、犬星狀病毒（CAstV）等新發(fā)病毒也是致犬腹瀉的重要病原。目前，多種病毒的混合感染已十分常見，不僅加大了臨床獸醫(yī)對(duì)犬病毒性腹瀉的診斷難度，而且常常會(huì)增加疾病的嚴(yán)重程度，從而增加治療難度。CanineCV 于2012 年首次在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)[3]，該病毒可引起犬急性腹瀉、嘔吐等癥狀，并且該病毒可能與宿主免疫抑制有關(guān)[4-5]，國(guó)內(nèi)關(guān)于CanineCV病例的報(bào)道很少。本文對(duì)接診的一例腹瀉犬進(jìn)行了犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒、犬瘟熱病毒、犬圓環(huán)病毒、犬星狀病毒5 種犬腹瀉病毒的PCR 檢測(cè)，以確診引發(fā)腹瀉的病原，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 病犬基本情況

2018年12月，在動(dòng)物醫(yī)院接診了一只6月齡雌性博美犬，體重為2.90 kg。該犬疫苗接種情況為：首免使用英特威二聯(lián)疫苗，第二、三、四次免疫使用英特威四聯(lián)苗及狂犬病疫苗。發(fā)病時(shí)間距最后一次免疫接種完成有30 d。就診前一日該犬出現(xiàn)嘔吐，由最初吐出食物到最后吐出白色帶泡沫的黏液，之后出現(xiàn)拉稀、血便。

2 臨床癥狀

體溫40.3 ℃（犬正常體溫為38.0～39.5 ℃），精神沉郁，嘔吐頻繁，鼻汗少，便血并帶有腥臭味，可視黏膜蒼白，被毛凌亂，喜臥。

3 5種致犬腹瀉病毒的PCR檢測(cè)

3.1 樣本采集及核酸提取 使用無(wú)菌棉簽蘸取適量糞便樣本于采樣管中，加入PBS 緩沖液，按照1∶5的比例稀釋，渦旋振蕩5 min，置于4 ℃離心機(jī)中以12 000 r∕min 離心15 min。離心后取上清液于新的1.5 mL EP管中，采用酚-氯仿法提取樣本中的總DNA，采用Trizol 法提取樣本中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法，對(duì)CPV-2、CCoV、CDV、CAstV 和CanineCV 5 種病毒進(jìn)行PCR 檢測(cè)，引物由上海生工生物公司合成，引物信息見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物信息

PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×rTaq PCR PreMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 或cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR 產(chǎn)物10 μL 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min），觀察結(jié)果并拍照。

3.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果 CCoV、CDV 和CAstV 均為陰性，CPV-2 和CanineCV 為陽(yáng)性，部分檢測(cè)電泳圖見圖1、圖2。

圖1 CPV-2 PCR檢測(cè)凝膠電泳圖

圖2 CanineCV PCR檢測(cè)凝膠電泳圖

4 診斷結(jié)果

根據(jù)臨床檢查和PCR檢測(cè)結(jié)果，診斷該患病犬為CPV-2和CanineCV的混合感染。

5 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)病犬進(jìn)行了CPV-2、CCoV、CDV、CAstV和CanineCV 5種病毒的特異性PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示為CPV-2 和CanineCV 的混合感染，排除了其他3種病毒的感染。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于犬腹瀉病原的診斷常限于CPV-2、CCoV 和CDV 等常見病原，對(duì)于新發(fā)病毒的檢測(cè)還重視不夠。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)四川省犬腹瀉糞便樣本的調(diào)查結(jié)果顯示：CanineCV 和CAstV 的檢出率分別為15.4%（32∕208）和39.3%（42∕107）[11]，因此對(duì)新發(fā)犬腹瀉病毒的檢測(cè)值得關(guān)注。

最近的研究顯示，CanineCV 常 與CPV-2 共同感染，在腸道疾病中起協(xié)同作用，從而導(dǎo)致臨床癥狀加重；或者在其他病原體損傷宿主腸道上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞后，CanineCV致病性發(fā)生變化，從而加重病情[12]。2016年，孫文超等[13]首次在中國(guó)大陸從犬血清樣品中檢測(cè)出CanineCV病毒。2018年，嚴(yán)楠等[11]對(duì)四川省部分地區(qū)寵物醫(yī)院的犬腹瀉樣本進(jìn)行CanineCV 熒光定量PCR 檢測(cè)，檢出率為15.4%（32∕208）。目前可以確定的是，CanineCV 可導(dǎo)致犬出現(xiàn)脈管炎、壞死性淋巴結(jié)炎等。美國(guó)于2016年、德國(guó)于2017年分別報(bào)道了CanineCV 與CPV-2混合感染導(dǎo)致犬急性出血性腹瀉和急性死亡的病例[12，14]。

CPV-2 能夠引起患犬急性腸炎、白細(xì)胞減少、嘔吐及幼犬的心肌炎等病癥。該病一年四季皆可發(fā)生，以發(fā)病急、病程短、傳染性強(qiáng)、死亡率高為特點(diǎn)，是危害我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。目前對(duì)該病毒的防控主要以疫苗為主，商品化的CPV-2疫苗已有不少，即使使用了CPV-2疫苗進(jìn)行免疫，也仍有可能出現(xiàn)CPV-2感染。免疫失敗的原因可能是疫苗方面的原因，如疫苗使用不當(dāng)、流行毒株發(fā)生變異與疫苗毒株不匹配等；也有可能是免疫犬自身的原因，如營(yíng)養(yǎng)不良、寄生蟲感染、患有免疫抑制性疾病等[15]。這些因素都會(huì)使CPV-2 的免疫接種不可靠，這對(duì)CPV-2的防控提出了新的考驗(yàn)。有趣的是，本次接診的患犬根據(jù)其免疫記錄可知其已經(jīng)過(guò)4次疫苗免疫，其發(fā)病時(shí)間距最后一次免疫接種完成僅有30 d，即使接種了CPV-2 疫苗，也仍然出現(xiàn)了CPV-2 感染。雖然無(wú)法確定兩種病毒感染的先后順序，但該犬存在感染CanineCV后自身出現(xiàn)免疫抑制，最后造成CPV-2感染的可能性。這也提醒我們有必要將CanineCV 作為犬腹瀉病原診斷的一個(gè)重要檢測(cè)項(xiàng)目。