劉家榜 ，趙 珊 ，張 聰 ，馮俊彥 ，李 明 ，屈會(huì)娟 ，黎 青 ，李建偉 ，林 楊 ，蒲志剛

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川成都610061；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川成都610066）

甘薯（Ipomoea batatasLam.）俗稱紅薯、紅苕、番薯等，屬旋花科（Convolvulaceae）甘薯屬（Ipomoea）蔓生多年生草本植物，是重要的糧食和飼料作物，具有較高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。2009年世界甘薯種植面積為677萬hm2，薯干總產(chǎn)量為2 112萬t[4]。甘薯也是我國主要栽培作物之一，常年種植面積在6×106hm2左右，我國甘薯栽培面積和總產(chǎn)量均居世界首位，而四川是我國甘薯種植面積最大的省份之一，每年穩(wěn)定種植面積在47萬hm2以上，鮮薯總產(chǎn)穩(wěn)定在1 000萬t左右[5-7]。

長期以來，我國主要通過選擇優(yōu)質(zhì)甘薯種質(zhì)資源或野生材料作為親本進(jìn)行雜交，從后代中篩選出具有優(yōu)良性狀的甘薯新品系（種）[8]。但由于甘薯可利用種質(zhì)資源較少、不易開花、種間雜交親和性較低等原因，雜交育種技術(shù)在甘薯育種上的應(yīng)用存在較大局限性[9-10]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)合生物技術(shù)和輻射誘變技術(shù)進(jìn)行甘薯種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種改良，在甘薯育種中呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景[11]。

經(jīng)過多年發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在動(dòng)物、植物、微生物研究中得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了大量的研究成果[12-17]，可以預(yù)見，在今后的研究中分子標(biāo)記技術(shù)將發(fā)揮越來越重要的作用。但是目前在甘薯育種研究上可以使用的分子標(biāo)記仍然較少[18]。

本研究利用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)（Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT）[19]、重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)（Inter-simple Sequence Repeat，ISSR）[20]、CAAT盒多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)（CAATBox-derivedPolymorphism，CBDP）[21]對(duì)甘薯品種川薯34和川紫薯2號(hào)及其60Co-γ輻射誘變后代進(jìn)行基因組掃描，比較不同標(biāo)記對(duì)甘薯誘變后代變異的掃描結(jié)果；同時(shí)利用標(biāo)記掃描結(jié)果評(píng)價(jià)不同甘薯誘變后代的變異情況，旨在為今后分子標(biāo)記技術(shù)和輻射誘變技術(shù)在甘薯育種中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究從2個(gè)四川主栽甘薯品種川薯34和川紫薯2號(hào)懸浮細(xì)胞輻射誘變后代中[22]分別隨機(jī)選取32株作為試驗(yàn)材料，并使用川薯34和川紫薯2號(hào)未誘變材料作為對(duì)照。參試材料均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所生物育種中心提供；懸浮細(xì)胞輻射處理由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所輻照中心完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘薯基因組DNA提取 參試材料基因組DNA提取參照黃艷嵐等[23]的方法進(jìn)行，略有改進(jìn)。稱取0.5～1.0 g新鮮甘薯葉片，加入液氮研磨至粉末，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入0.8 mL預(yù)熱的CTAB，混勻后，65℃水浴45 min，期間上下顛倒4～5次；加入0.8 mL氯仿，上下顛倒混勻，12 000 r/min離心10min；吸取上清液，加入-20℃預(yù)冷的異丙醇1mL，上下顛倒沉淀除DNA后，依次用70%、95%、100%濃度的酒精各洗2遍，晾干后，用1×TE緩沖液（含有20 ng/μLRNA酶）溶解DNA；然后使用Scandrop（Analyticgena）微量核酸測定儀和1%瓊脂糖電泳檢測DNA的濃度和純度。根據(jù)檢測結(jié)果，將DNA原液稀釋到50 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)條件 使用的SCoT引物、ISSR引物、CBDP引物以及PCR反應(yīng)程序及體系均參照已報(bào)道的方法[19-21，24]，略有改進(jìn)（表 1）。PCR 反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體系均為20 μL，分別含有2 μL甘薯基因組 DNA、10 μL 的 2×TaqPCR Mix、3 μL 引物和5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)所需藥品、試劑以及引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 引物信息

SCoT引物PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，45～62℃退火1 min，72℃延伸2 min，38個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸5 min，冷卻至12℃保存。ISSR引物PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性 45 s，50～55℃退火 45 s，72℃延伸1min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸5 min，冷卻至12℃保存。CBDP引物PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性1min，35 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃預(yù)變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min，15℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 取PCR產(chǎn)物6 μL與5 μL DNA loading buffer混合，用2%的瓊脂糖凝膠在110 V電壓下進(jìn)行電泳分離檢測，于紫外成像儀上拍照分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)檢測樣品中電泳條帶的有無，采用二進(jìn)位制記錄，即在相同遷移率處有帶記為1，無帶記為0，記錄所有引物擴(kuò)增結(jié)果；然后使用NTSYSpc 2.11和Popgen 32軟件對(duì)各品種及其誘變后代的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行計(jì)算及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射誘變甘薯后代PCR擴(kuò)增多態(tài)性分析

川紫薯2號(hào)和川薯34懸浮細(xì)胞經(jīng)過低劑量輻射誘變后，后代植株在葉形、葉色、藤蔓長度、藤蔓顏色、薯塊形狀、薯塊大小等方面均出現(xiàn)不同程度的變異（圖1）。分別隨機(jī)選取各品種誘變后代32株，進(jìn)行分子標(biāo)記掃描分析，結(jié)果表明，6條SCoT引物在參試材料中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物主要集中在200～2 000 bp（圖2），在川薯34及其突變后代中共擴(kuò)增出條帶38條，平均每條引物可產(chǎn)生6.33條條帶，發(fā)現(xiàn)變異條帶4條，變異率為10.5%；在川紫薯2號(hào)中共擴(kuò)增出40條條帶，平均每條引物擴(kuò)增6.67條條帶，其中發(fā)現(xiàn)變異條帶7條，變異率17.5%（表2）。

表2 3種分子標(biāo)記掃描結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2條ISSR引物在川薯34誘變后代材料中，共擴(kuò)增得到5條條帶，引物815擴(kuò)增獲得2條條帶，引物873擴(kuò)增獲得3條條帶；擴(kuò)增片段主要處于100～2 500 bp；其中，變異條帶1條，變異率20.0%。在川紫薯2號(hào)誘變后代中，共擴(kuò)增獲得6條條帶，引物815、873擴(kuò)增分別獲得3條條帶（表2），擴(kuò)增產(chǎn)物主要處于600～2 500 bp，未檢測到變異條帶。

6條CBDP引物在參試材料中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度處于100～2 000 bp（圖2）。在32份川薯34誘變后代中檢測到35個(gè)擴(kuò)增片段，平均每條引物獲得5.83條條帶，檢測到變異條帶13條，變異率為37.1%；在川紫薯2號(hào)材料中，共獲到36條條帶，其中，變異條帶7條，變異率為19.4%（表2）。

2.2 遺傳多樣性分析

利用Popgen 32軟件對(duì)3種分子標(biāo)記在2個(gè)甘薯品種及其輻射誘變后代中的掃描結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在SCoT引物掃描結(jié)果中，川薯34的遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.94～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.99，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.032 0，Shannon's多樣性指數(shù)為0.019 5，平均等位基因效應(yīng)為1.028 3；川紫薯2號(hào)的遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.92～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.99，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.037 0，Shannon's多樣性指數(shù)為0.061 1，平均等位基因效應(yīng)為1.051 1。

在ISSR引物掃描結(jié)果中，川薯34的遺傳相似性系數(shù)范圍在0.80～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.97，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.0742，Shannon's多樣性指數(shù)為0.1116，平均等位基因效應(yīng)為1.1180。由于在川紫薯2號(hào)誘變后代中未發(fā)現(xiàn)變異條帶，其遺傳相似性系數(shù)、平均Nei's基因多樣性指數(shù)、Shannon's多樣性指數(shù)、平均等位基因效應(yīng)均未進(jìn)行分析。

在CBDP引物掃描結(jié)果中，川薯34的遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.80～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.95，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.099 2，Shannon's多樣性指數(shù)為0.158 9，平均等位基因效應(yīng)為1.147 9；川紫薯2號(hào)的遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.86～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.98，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.048 2，Shannon's多樣性指數(shù)為0.078 5，平均等位基因效應(yīng)為1.067 0。

2.3 分子標(biāo)記掃描結(jié)果的聚類分析

使用NTSYSpc 2.11軟件中的UPGMA聚類方法，將SCoT引物、ISSR引物以及CBDP引物的掃描結(jié)果進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。對(duì)川紫薯2號(hào)及其誘變后代的分析結(jié)果表明，當(dāng)遺傳相似度為0.973時(shí)，34份參試材料被分別聚到4個(gè)類群中，其中，類群Ⅰ包含31份材料，剩余3個(gè)類群中分別包含1個(gè)材料。當(dāng)遺傳相似度為0.986時(shí)，31份材料又可劃分為8個(gè)亞群，亞群Ⅰ包含24份材料，結(jié)果顯示，這些誘變材料基本未發(fā)生變異；另外7個(gè)亞群分別包含1份材料，遺傳相似性差異較大，差異明顯。原始品種川紫薯2號(hào)與23份誘變后代被聚到類群Ⅰ中，另外8份材料被單獨(dú)區(qū)分開，表明在甘薯品種川紫薯2號(hào)的懸浮細(xì)胞低劑量輻射誘變后代中發(fā)生了一定程度的較小變異，但絕大多數(shù)未發(fā)生變異（圖3）。

對(duì)川薯34及其輻射誘變后代3種標(biāo)記掃描結(jié)果的分析表明，當(dāng)遺傳相似度為0.97時(shí)，34份參試材料被分別聚到5個(gè)類群中，其中，類群Ⅰ、類群Ⅲ、類群Ⅳ和類群Ⅴ這4個(gè)類群內(nèi)分別僅包含1份材料；類群Ⅱ包含30份材料，類群Ⅱ在相似度為0.98時(shí)，30份材料被分別聚到6個(gè)亞群中，其中，有13份材料與對(duì)照親本的遺傳相似性達(dá)到1.00，被完全聚到一起，此外，cs34-14和cs34-23以及cs34-8和cs34-9這2組（4個(gè)材料）雖然均發(fā)生了變異，但是它們之間的遺傳相似性系數(shù)分別達(dá)到了1.00，也被完全聚到了一起。本研究結(jié)果表明，在川薯34輻射誘變后代中多數(shù)個(gè)體都發(fā)生了不同程度的變異，但整體變異程度較低。但是也有部分誘變后代變異不明顯，在分子標(biāo)記掃描結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，在聚類結(jié)果中這些個(gè)體與親本被完全聚到了一起（圖4）。從聚類圖4也可以看出，部分誘變后代雖然發(fā)生了變異，但是也被完全聚到了一起，說明在甘薯基因組中可能存在易變位點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

隨著近年來生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已在生物分子育種、植物遺傳指紋圖譜構(gòu)建、文庫構(gòu)建以及生物遺傳多樣性分析等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了顯著的成效[25-27]。目前，分子標(biāo)記技術(shù)根據(jù)技術(shù)和方法的不同，其檢測技術(shù)和檢測分辨率差異很大，可以分為三大類：以分子雜交為核心的標(biāo)記技術(shù)，如RFLP技術(shù)；以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，如RAPD、AFLP、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)[28-29]；基于測序技術(shù)的新型標(biāo)記技術(shù)，如SNP等標(biāo)記[30]。南文卓等[31]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)30份甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，11對(duì)SSR引物可擴(kuò)增出57條清晰的條帶，其中，多態(tài)性條帶53條，多態(tài)性比率93.0%，平均每對(duì)引物5.18條。趙麗麗等[32]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了輻射誘變白刺花M2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20條多態(tài)性較好的ISSR引物擴(kuò)增產(chǎn)生141條清晰譜帶，多態(tài)性條帶有75條，多態(tài)性比率為53.2%，表明在輻射誘變材料的后代中存在豐富的遺傳多樣性，為分子標(biāo)記與輻射誘變技術(shù)在育種中的應(yīng)用提供了參考。翟秀明等[33]和謝向譽(yù)等[34]運(yùn)用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)茶樹和木薯的生長和突變體進(jìn)行了分析，證明了SCoT分子標(biāo)記技術(shù)可用于掃描分析植物突變體。

本研究使用SCoT、ISSR和CBDP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)2個(gè)甘薯品種及其輻射誘變后代進(jìn)行了掃描分析，結(jié)果表明，SCoT、ISSR和CBDP等3種標(biāo)記每條引物平均獲得條帶數(shù)最多的是CBDP引物，其次為SCoT引物，ISSR引物獲得的條帶數(shù)最少。SCoT、ISSR和CBDP等3種標(biāo)記在突變體中獲得的多態(tài)性片段占擴(kuò)增總片段數(shù)的比例中，在川薯34及其誘變后代中分別為0.11、0.20和0.37；在川紫薯2號(hào)及其誘變后代中分別為0.18、0和0.19。說明無論在擴(kuò)增條帶數(shù)目上還是在獲得的突變體后代的多態(tài)性上，目前在甘薯分子研究中使用較少的SCoT分子標(biāo)記和CBDP分子標(biāo)記的表現(xiàn)均優(yōu)于ISSR分子標(biāo)記，且CBDP分子標(biāo)記結(jié)果最佳。此外，由于SCoT分子標(biāo)記和CBDP分子標(biāo)記均屬于單引物標(biāo)記，操作簡單，因此，可以將其應(yīng)用到甘薯分子標(biāo)記研究中去，豐富甘薯分子標(biāo)記種類。

本研究通過對(duì)2個(gè)甘薯品種及其輻射誘變后代的分子標(biāo)記掃描及聚類分析發(fā)現(xiàn)，原始材料及輻射誘變后代之間的遺傳相似性較高，而且存在多個(gè)與原始材料基本相同的突變后代，其原因可能與本研究的誘變材料是通過低劑量輻射誘變懸浮細(xì)胞獲得的[33]，其基因組變異較小有關(guān)。通過對(duì)比川薯34及其誘變后代以及川紫薯2號(hào)及其誘變后代的聚類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種的誘變后代在基因組變異方面存在較為明顯的區(qū)別，川薯34誘變后代的變異率及變異幅度均顯著高于川紫薯2號(hào)，初步說明懸浮細(xì)胞對(duì)低劑量輻射誘變產(chǎn)生的變異大小與品種存在一定的關(guān)系。在川薯34輻射誘變后代中，有2組分別包含2個(gè)誘變材料被完全聚到了一起，可能與川薯34中存在容易發(fā)生誘變的位點(diǎn)有關(guān)。在今后的研究中，可以根據(jù)不同的甘薯品種選擇最優(yōu)的輻射劑量進(jìn)行誘變。