曹春玲，楊聰翀，屈小中，韓 冰△，王曉燕△

(1．北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院，牙體牙髓科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室，北京 100081； 2．中國科學院大學材料科學與光電技術(shù)學院，北京 100049)

近年來，牙髓再生成為口腔牙髓病學研究的熱點議題之一。牙髓干細胞(human dental pulp cells，hDPCs)是牙髓組織中易得的一類成體干細胞[1]，在不同因子和微環(huán)境的調(diào)控下可發(fā)揮其多分化潛能，是牙體組織損傷再生修復能力的重要影響因素[2-5]。牙髓再生組織工程除了需要干細胞、支架材料、生長因子的共同作用，還需要支架材料具有可操作性，便于置入狹長細小的根管空腔中。近來，水凝膠作為組織工程支架用于牙髓再生得到眾多學者的關(guān)注[6-9]。水凝膠是一種極為親水的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[9]，其三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和黏彈性與生物體內(nèi)由生物大分子構(gòu)成的細胞外基質(zhì)極為類似，具有良好的生物相容性，可以較好地模擬細胞生活的微環(huán)境。水凝膠可制備為可注射劑型，可注射水凝膠在根管內(nèi)原位形成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)后[8, 10]，可以三維包封細胞[11-12]。

殼聚糖(chitosan, CS)是天然多糖，此類生物材料的臨床試驗研究表明，將其植入、注射、局部應用或攝入動物體內(nèi)后未見任何過敏或炎性反應，具有良好的生物相容性，同時又對細菌、真菌、寄生蟲有一定的毒性，可發(fā)揮天然抑菌作用[13]。羥乙基殼聚糖(glycol-chitosan, GC)是殼聚糖的衍生物，其水溶性得到了提高，便于水凝膠的制備。GC與端苯甲醛基修飾的聚乙二醇(OHC-PEO-CHO)通過席夫(Schiff)反應可發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化，形成柔軟的水凝膠網(wǎng)絡，但GC水凝膠機械強度較低，難以作為組織工程支架提供足夠的力學支持。因此，本課題組在以GC-OHC-PEO-CHO為水凝膠主網(wǎng)絡的基礎(chǔ)上穿插了海藻酸鈉(alginate, Alg)-氯化鈣(CaCl2)次網(wǎng)絡，制備出GC基雙網(wǎng)絡水凝膠，其力學性能獲得提升[8]。

水凝膠的力學性能除與其網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)有關(guān)外，也與其組成成分的濃度配比有關(guān)。隨著組分濃度的提高，水凝膠的力學性能增強[11]。不同力學性能的水凝膠模擬的細胞外基質(zhì)硬度不同，影響著其中細胞的生物學行為。本研究旨在通過構(gòu)建GC基單/雙網(wǎng)絡水凝膠和hDPCs的細胞支架系統(tǒng)，探索不同組成配比的GC基單/雙網(wǎng)絡水凝膠及其理化性能對hDPCs增殖與分化的作用，為探索更適合根管內(nèi)牙髓再生的材料提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設備

羥乙基殼聚糖(GC)和海藻酸鈉(Alg)購自美國Sigma-Aldrich公司；苯甲醛修飾的聚乙二醇(OHC-PEO-CHO)由中國科學院化學研究所合成； DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國ScienCell公司和天津康源公司；細胞增殖/毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)購自日本同仁化學研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；SYBR Green酶購自瑞士Roche公司；Von Kossa染色試劑盒購自北京Solarbio公司。

實驗所用設備：萬能力學實驗機購自美國Instron公司；精密電子天平購自瑞士Mettler Toledo公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡購自美國Leica公司；酶標儀(ELx800)購自美國BioTek公司；超微量分光光度計(NanoDrop 2000)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；梯度PCR儀(EPS 5345)購自德國Eppendorf公司；real-time RT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 羥乙基殼聚糖基單/雙網(wǎng)絡水凝膠的制備

配制質(zhì)量分數(shù)為羥乙基殼聚糖6%(或3%)，氯化鈣 2%(或1%)，海藻酸鈉6%(或3%)，OHC-PEO-CHO 2%(或1%)的溶液(表1)，將各組分溶液在孔板中輕柔攪拌混合均勻，通過席夫反應和靜電相互作用實現(xiàn)在生理環(huán)境條件(pH=7.4, 37 ℃)的雙網(wǎng)絡凝膠化(下文縮寫為DN3131和DN6262)。

表1 分組及組分濃度Table 1 Component concentration of each group

配制質(zhì)量分數(shù)為羥乙基殼聚糖3%的溶液和OHC-PEO-CHO 1%的溶液，通過席夫反應動態(tài)交聯(lián)實現(xiàn)在生理環(huán)境條件(pH=7.4, 37 ℃)的單網(wǎng)絡凝膠化 (下文縮寫為GC31)。模式圖見圖1。

1.3 水凝膠的降解性評價

將水凝膠完全浸置于DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，37 ℃條件下放置，每3天更換新的培養(yǎng)液，分別于第0天、第7天、第14天、第21天稱重：將水凝膠表面的液體用吸水紙輕輕擦干，在精密電子天平上稱重。計算重量減少的百分比。

1.4 水凝膠的可注射性研究

根管模型注射實驗：選擇NISSIN透明S1單根管模型，使用Protaper Sx-F3序列預備，使用手用銼將根管根尖區(qū)預備至70#。使用雙聯(lián)注射器進行模擬根管內(nèi)注射。

體外注射時間測定：恒力15 N施以雙聯(lián)注射器，記錄不同組成配比的水凝膠推出0.5 mL體積所需的時間。針頭型號為21G。

1.5 水凝膠的力學性能檢測

制備不同濃度配比的GC基單/雙網(wǎng)絡水凝膠，通過雙聯(lián)混藥器混合注入直徑為10 mm的圓柱形模具，30 min后得到凝膠，脫模得到直徑為10 mm, 高度為10 mm的圓柱體，使用萬能試驗機測定其斷裂應力，測試條件：載荷100 N，加載速度1 mm/min。

1.6 GC基單/雙網(wǎng)絡水凝膠包封hDPCs三維培養(yǎng)的體外生物學研究

按照1.4所示步驟及比例制備GC31、DN3131和DN6262，預先將細胞消化為懸液，與各組分溶液在孔板中攪拌混合均勻，分別形成3組細胞終濃度為1×106/mL的GC基單/雙網(wǎng)絡水凝膠。

1.6.1GC基單/雙網(wǎng)絡水凝膠培養(yǎng)hDPCs的增殖能力檢測

hDPCs分別于培養(yǎng)的第1、4、7、10、14天，使用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活力。Calcein-AM/PI活死細胞染色法分別對第1、7、14天各組三維培養(yǎng)的細胞染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞數(shù)量和狀態(tài)，其中綠染為活細胞，紅染為死細胞。

1.6.2礦化誘導液培養(yǎng)條件下，GC基單/雙網(wǎng)絡水凝膠培養(yǎng)hDPCs的分化能力檢測

礦化誘導液(含50 mg/L抗壞血酸、5 mmol/L β-磷酸甘油和10 nmol/L地塞米松)浸泡各組水凝膠，體外三維培養(yǎng)14 d后分別檢測成牙本質(zhì)向分化標志物及礦化相關(guān)因子的表達情況和礦化結(jié)節(jié)的形成。每3天更換新的培養(yǎng)液。

1.6.2.1實時熒光定量PCR測定 利用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實時熒光定量PCR法檢測DMP-1、DSPP、ALP表達，相關(guān)引物序列見表2。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，以β-actin為內(nèi)參照，實驗重復3次。

1.6.2.2組織學染色 將體外培養(yǎng)14 d細胞/水凝膠三維支架用PBS沖洗后，固定于4%(體積分數(shù))多聚甲醛中，乙醇序列脫水，制備石蠟切片，厚度為5 μm;然后切片脫臘、水化，進行Von Kossa染色。

表2 引物序列Table 2 The chain of reaction primers

DSPP, dentin sialophosphoprotein; DMP-1, dentin matrix protein-1; ALP, alkaline phosphatase.

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析,可注射性能、降解率、CCK-8測定、real-time RT-PCR結(jié)果均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK法，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠的可注射性能

GC31、DN3131、DN6262在生理條件下(37 ℃, pH=7.4)均可完成溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，GC31的凝膠時間約為200 s，DN3131、DN6262的凝膠時間約為30～50 s，其大體觀如圖2。3組水凝膠都可通過21G針頭順暢推出注入根管模型內(nèi)達根管全長，其典型過程見圖3。向根管內(nèi)推注相同體積水凝膠，GC31組的推注時間最短，DN3131次之，DN6262推注時間較DN3131長(P<0.05，圖4)。

2.2 水凝膠的斷裂應力

GC31單網(wǎng)絡水凝膠的斷裂應力為1.10 kPa，雙網(wǎng)絡水凝膠的斷裂應力高于單網(wǎng)絡水凝膠(P<0.05)， DN3131的斷裂應力為7.33 kPa，DN6262的斷裂應力明顯升高，可達43.30 kPa(圖5)。

2.3 水凝膠的降解性能

GC31水凝膠的體外降解速度最快(P<0.05)，1周后，GC31組的剩余質(zhì)量百分比已不足60%，3周后，GC31組的剩余質(zhì)量百分比已不足20%(圖6A)。雙網(wǎng)絡水凝膠降解速率較單網(wǎng)絡水凝膠明顯更慢，剩余質(zhì)量百分比仍可維持在70%～90%。DN3131組與DN6262組的降解率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)， 3周后雙網(wǎng)絡水凝膠大致保持原有形態(tài)(圖6B)。

2.4 hDPCs在水凝膠中的增殖能力

在各組水凝膠中，細胞均成球形生長，分布較均勻。CCK-8法檢測(圖7A)發(fā)現(xiàn)3組hDPCs均持續(xù)增殖，GC31單網(wǎng)絡水凝膠組中的細胞較雙網(wǎng)絡水凝膠組的增殖能力高，細胞數(shù)量多(P<0.05)。雙網(wǎng)絡水凝膠組中， DN3131組的hDPCs較DN6262組中的增殖能力高，細胞數(shù)量多(P<0.05)。Calcein-AM/PI雙染細胞結(jié)果顯示(圖7B)，活細胞量均隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，其中GC31組較雙網(wǎng)絡水凝膠組中的活細胞數(shù)量多，且部分細胞聚集以細胞團的形式存在。

2.5 hDPCs在水凝膠中的分化能力

誘導培養(yǎng)的第14天，DN3131、DN6262中DMP-1和 ALP相對表達量較GC31組高(P<0.05)。DN3131組中DSPP相對表達量也高于GC組(P<0.05)，但DN6262組中DSPP相對表達量與GC31組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖8)。

Von Kossa染色(圖9)結(jié)果顯示，礦化誘導條件下，在DN3131和DN6262組可見明顯的深褐色染色的礦化結(jié)節(jié)，且成團塊狀。在GC31組中，在部分細胞的外周有淺棕色鈣沉積染色，為零星顆粒狀散在分布。

3 討論

水凝膠能夠改良為可注射劑型，能夠適合不規(guī)則的根管形態(tài)[14-15]，在牙髓再生研究中具有良好的應用前景。本研究選擇的3組不同組分配比的可注射羥乙基殼聚糖基水凝膠，可通過注射器混合推出，在溫和的生理條件下(37 ℃)發(fā)生溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)化，并且能充盈根管空腔，都具有良好的可操作性，同時，觀察到不同組成配比的水凝膠的可操作時間有所不同。實際操作過程中，可操作時間與溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)化的時間直接相關(guān)，若相轉(zhuǎn)化時間短，則在注射器內(nèi)快速凝膠化后失去流動性，難以注射[16]。本研究GC與OHC-PEO-CHO間的凝膠化是由于動態(tài)共價鍵(亞胺鍵)的形成，反應較慢，可操作時間長。而雙網(wǎng)絡水凝膠中除外GC-OHC-PEO-CHO主網(wǎng)絡, 還互穿海藻酸鈉-CaCl2次網(wǎng)絡，海藻酸鈉與CaCl2間的離子鍵形成迅速，使雙網(wǎng)絡水凝膠的溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)化時間明顯縮短，可操作時間縮短。當交聯(lián)分子的濃度增大，交聯(lián)反應速率加快，凝膠時間進一步減短，可注射性下降。本研究GC31、DN3131、DN6262的可注射性依次減小，當組分濃度進一步升高時，出現(xiàn)凝膠堵塞注射針管的情況，難以注射入根管內(nèi)，故本研究未將更高組分濃度的雙網(wǎng)絡水凝膠納入研究范疇。

對于水凝膠材料，通過調(diào)控各組分配比可以改變其力學性能和耐降解性能[11, 17-19]。與單網(wǎng)絡水凝膠相比，雙網(wǎng)絡水凝膠因其互穿網(wǎng)絡系統(tǒng)和有效的能量擴散，所以具備較強的韌性、機械強度和穩(wěn)定性[20]。在雙網(wǎng)絡水凝膠中，在一定范圍內(nèi)，當凝膠交聯(lián)分子的濃度升高，則機械性能增強、基質(zhì)硬度增大、孔隙率降低[21]。本研究觀察到雙網(wǎng)絡水凝膠的抗壓縮性能、耐降解性能均優(yōu)于單網(wǎng)絡水凝膠組，且雙網(wǎng)絡水凝膠組中，組分濃度高的DN6262組的抗壓縮性能、耐降解性能優(yōu)于組分濃度較低的DN3131組，也證實了以上推論。既往學者研究表明，牙髓-牙本質(zhì)復合體類似物形成的時間為3～6周不等，因此支架材料在這段時間內(nèi)維持機械強度的穩(wěn)定,實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性分子的傳遞將對細胞的分化有著積極的影響[3, 22-23]。

同其他支架材料相比，水凝膠作為可三維包封細胞的一種支架材料，形成干細胞龕(niche)，模擬細胞外基質(zhì)與細胞的相互作用，調(diào)節(jié)其中細胞的自我更新能力和分化能力[24]。有研究表明[25]，同二維培養(yǎng)相比，3D微環(huán)境更能促進細胞的多向分化潛能，但對于細胞增殖行為的影響尚未確切[26]。目前的牙髓組織工程研究大多局限于將牙源性細胞種植在支架的表面，研究細胞在支架表面和內(nèi)部的生物學行為[27-28]，而對三維培養(yǎng)細胞的行為改變研究相對較少見。本研究觀察到細胞在水凝膠中均成球形生長，并形成細胞球形聚集體，這是由于細胞在凝膠中不與特定的黏附位點結(jié)合，使細胞與細胞間的接觸和胞間信號交流增強[29]。有研究表明，水凝膠包封的球狀體細胞更易存活[30]，更不易發(fā)生凋亡。

本研究構(gòu)建的3組可注射型水凝膠對hDPCs增殖能力的促進作用不同，其可能原因是由于3組水凝膠理化性能不同，細胞感受到的細胞外基質(zhì)硬度不同。細胞外基質(zhì)硬度可作為機械刺激信號傳遞給細胞，影響細胞骨架的收縮和細胞有絲分裂通路的開啟[31]，從而影響增殖行為。GC水凝膠網(wǎng)絡中的GC與OHC-PEO-CHO利用席夫反應化學結(jié)合形成的動態(tài)交聯(lián)鍵在細胞增殖的過程中維持著斷裂和連接的自我平衡，有利于細胞間接觸的同時又可以提供一個合適的增殖空間，促進了細胞的增殖行為。本研究觀察到，在較為柔軟的單網(wǎng)絡水凝膠模擬的細胞外基質(zhì)中，人牙髓細胞表現(xiàn)出較高的增殖能力，證實了以上推論。而雙網(wǎng)絡水凝膠由于海藻酸鹽-鈣離子通過離子鍵形成的次網(wǎng)絡在GC主網(wǎng)絡中穿插，使分子鏈的密集度升高，細胞的增殖空間減小，細胞在其中的增殖行為受到一定程度的抑制。隨著交聯(lián)分子濃度的升高和支架降解速度減慢，細胞的增殖空間更小，在四周束縛的環(huán)境中，細胞的增殖相應減緩[32]，本研究DN3131組和DN6262組內(nèi)細胞的增殖能力較低，證實了以上推論。

隨著水凝膠支架基質(zhì)硬度的改變，細胞的分化行為也受到影響。有研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)硬度較高時，細胞骨架較為整齊，傾向生成礦化組織，而基質(zhì)硬度較低時，傾向于生成類牙髓樣軟組織[4]。本實驗中，雙網(wǎng)絡水凝膠模擬的細胞外基質(zhì)的硬度較高，同時其耐降解性使得較高的硬度得以維持，觀察到DN3131組和DN6262組內(nèi)細胞成牙本質(zhì)相關(guān)基因和礦化相關(guān)基因的表達水平和礦化結(jié)節(jié)生成水平均高于GC31組，說明雙網(wǎng)絡水凝膠與礦化誘導液協(xié)同作用促進了hDPCs成牙本質(zhì)向分化行為。

本研究僅觀察了不同組成配比的GC基水凝膠對hDPCs增殖和分化的影響，對其如何影響hDPCs增殖和分化的分子機制仍需進一步探討；需要構(gòu)建動物實驗模型進行體內(nèi)試驗；需要進一步研究GC基水凝膠對生長因子的載體功能，深入探索其作為牙髓組織工程支架的作用機制，從而發(fā)揮其應用潛能。

綜上所述，本研究制備的GC基單/雙網(wǎng)絡水凝膠均具有良好的根管內(nèi)可注射性能，其中雙網(wǎng)絡GC基水凝膠具有更好的耐降解性和力學性能。hDPCs在各組水凝膠中均持續(xù)增殖，且GC31單網(wǎng)絡水凝膠更有利于維持細胞的增殖活力。同單網(wǎng)絡GC基水凝膠相比，雙網(wǎng)絡GC基水凝膠在體外實驗中能更有效促進hDPCs的成牙本質(zhì)向分化和礦化。