郭冬陽 洪秀芳 沈靈芝 毛根祥 楊舟鑫

內毒素，即脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，它作為一種重要的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）被免疫細胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識別后，會激活下游信號通路，引起宿主細胞炎癥因子的產生和釋放，過量的炎癥因子釋放會導致一系列炎癥性疾病的發(fā)生，甚至膿毒癥或膿毒癥休克[1-2]。心臟微血管內皮細胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）與體內其他組織的內皮細胞類似，具有屏障、物質轉運、抗凝、促凝、調節(jié)血管收縮等作用，其功能障礙導致的血管通透性改變被認為是LPS 感染引起心肌損傷的關鍵環(huán)節(jié)之一[3-4]。人參屬傘形目五加科，作為傳統(tǒng)中藥材，自古就被譽為“百草之王”，有研究證明人參的肉質根可用于調整血壓、恢復心臟功能、神經衰弱及身體虛弱等癥。人參二醇（20 R-panaxadiol，PD）是人參、三七、西洋參、絞股藍等藥用植物中皂苷類物質的主要苷元，其分子量極小，更利于機體吸收發(fā)揮藥理活性[5]。有研究表明，PD 能夠有效抑制腫瘤細胞增殖，被認為是極具前景的抗癌藥物[6-7]。但是它在內毒素引起的CMECs 損傷中是否發(fā)揮一定作用及其相關分子機制還鮮有報道。本研究中采用LPS 和LPS 聯(lián)合PD 處理大鼠CMECs，利用轉錄組測序（RNA-seq）技術檢測細胞轉錄組變化，并采用定量PCR 對部分差異基因進行驗證，旨在研究LPS 感染狀態(tài)下，PD 對CMECs 基因表達的影響，篩選出差異表達基因和相關信號通路，探討PD 在LPS 引起的心血管內皮細胞損傷中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 SD 大鼠購買并飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，月齡1～2 個月，體重100～150g。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Ⅱ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶購自美國Sigma公司；內皮生長因子購自美國PeproTech 公司。實驗操作均得到浙江省醫(yī)學科學院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離及培養(yǎng) SD 大鼠麻醉后通過腹腔注射肝素抗凝20min，消毒后取出心臟組織，用D-Hanks 液洗滌數(shù)次；去除左右心房、室間隔和右心室，浸入75%乙醇中20～30s，之后剪除左心室游離壁外部約1/4 及心內膜，剩余心肌組織充分減碎至約1mm3小塊，D-Hanks 洗滌2 次后，加入約1ml 0.2%Ⅱ型膠原酶，置于37℃水浴中孵育30min；再加入等體積的0.02%胰酶，輕輕吹打后37℃震蕩孵育20min，至大部分組織塊消化完全。最后，加入含20%血清的培養(yǎng)液終止消化，經200 目篩網過濾，4℃條件下，1 000r/min 離心5min，D-Hanks 洗滌后收集細胞。收集的CMECs 用完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清及生長因子）重懸后接種于10cm 培養(yǎng)皿中，4h 后棄去未貼壁細胞。貼壁的CMECs 用于后續(xù)實驗。

1.2.2 RNA 提取和測序 原代CMECs 接種于6 孔板中，分別用LPS（100ng/ml）（LPS 組） 或LPS（100ng/ml）+PD（10μg/ml）處理（LPS+PD 組），每組3個復孔，6h 后收集細胞，Trizol 法提取總RNA，并進行質量控制。按照美國Illumina 生物技術公司RNA-seq 樣本制備試劑盒（mRNA-Seq sample preparation kit）說明構建cDNA 文庫。對照大鼠的基因組信息和完整的轉錄組信息，將測序出的reads比對到參考基因組上，進而對基因或轉錄本進行注釋和定量。將reads 比對到基因組后，采用StringTie（2016）對表達進行注釋和定量。StringTie 應用網絡流算法和可選的denovo 組裝，將復雜的數(shù)據(jù)集組裝成轉錄本。進一步計算基因和轉錄本的FPKM 值（每百萬外顯子片段堿基映射獲得的基因表達）。

1.2.3 差異轉錄本分析 利用Ballgown 對兩個不同處理組進行比較，得到P值、Q值和轉錄本間的差異倍數(shù)（fold-change）；本研究中將兩組進行比較，進行差異基因篩選，篩選條件為P＜0.05 和Fold change＞1.5 倍及＜0.66667 倍。

1.2.4 GO 功能類別及通路富集分析 GO 數(shù)據(jù)庫用樹狀分層的方式對基因及蛋白功能進行詳細描述，闡明了基因功能之間的層次關系。并將基因功能分為：分子功能（molecular function）、生物學過程（biological pathway）和細胞成分（cellular component）3 個類別。KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是系統(tǒng)分析基因及其編碼產物間關系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，信號通路分析（Pathway 分析）是基于KEGG 數(shù)據(jù)庫，對差異基因利用Fisher 精確檢驗和χ2檢驗，將目標基因參與的通路進行統(tǒng)計學分析，按照P＜0.05 進行篩選，篩選出顯著性差異的信號通路。

1.2.5 定量PCR 驗證 將測序的RNA 樣本逆轉錄為cDNA，對趨化因子配體（chemokine ligand，CCL）-11、白介素（interleukin，IL）-22、IL-17、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9 和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）5 個基因進行定量PCR驗證，定量PCR 使用SYBR R Premix ExTaq 進行分析，目的基因的mRNA 表達量均以β-actin 作為內參，用2-△△CT最小二乘法進行計算。每個樣本重復3 個復孔，每次實驗均重復3 次以上，以保證結果的穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Graphpad7.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RNA-seq 聚類分析結果見插頁圖1。

由插頁圖1 可見，不同處理組能夠完整分開，兩者對應的轉錄本表達差異較大，其中，紅色代表差異轉錄本在分組樣本中表達值高，綠色代表差異轉錄本在分組樣本中表達值低。通過對兩個處理組進行比較，得到2 256 個差異表達基因，其中上調表達基因845 個，下調表達基因1 411 個。

2.2 差異基因顯著富集的GO 分析結果見圖2。

根據(jù)2.1 分析結果中下調表達的差異基因的顯著性水平構建分布圖，可見在分子功能、生物學過程和細胞成分3 個類別基因中，顯著下調的功能基因主要富集于：細胞轉運和離子通道相關蛋白（離子轉運體、鈣離子、氯離子、金屬離子跨膜轉運等）、轉錄活性調節(jié)以及表觀遺傳修飾（組蛋白H3-K4 三甲基化修飾、表觀遺傳的負調控）等。

2.3 差異表達基因的通路顯著性富集分析結果見插頁圖3。

由插頁圖3 可見，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫分析，下調基因明顯富集于炎癥相關的信號通路：PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、IL-17 信號通路、趨化因子信號通路、cAMP 信號通路、補體相關通路等，此外還有一些代謝相關信號通路（甘油磷脂代謝和膽堿代謝等）。說明PD 主要影響炎癥信號通路表達。

2.4 定量PCR 驗證結果見圖4。

由圖4 可見，通過對測序結果中差異表達的5個基因（CCL-11、IL-22、IL-17、MMP-9 和EGF）進行定量PCR 驗證，證明這5 個基因的表達趨勢與測序結果一致，PD 處理后能顯著抑制CCL-11、IL-22、IL-17、MMP-9 和EGF 基因的表達，且差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中MMP-9 基因在PD 處理后差異顯著（P＜0.01）。

3 討論

革蘭陰性菌感染過程中，機體會產生一系列免疫應答反應以清除病原，而免疫應答失控會導致疾病的發(fā)生，甚至膿毒癥或膿毒癥休克這類危及生命的重癥[8-9]。LPS 感染引發(fā)的炎癥反應甚至膿毒癥及膿毒癥休克過程中，心臟組織的受損不可避免，而內皮細胞在其中扮演著重要角色[10]。很多研究揭示了LPS 感染與心肌損傷的關系：LPS 感染首先被免疫細胞識別并引發(fā)炎癥反應，導致內皮細胞骨架重構、VE-鈣黏附素的變化引起CMECs 間黏附連接結構解體，結構改變，血管通透性增加，大量液體滲入心臟組織間隙，加重組織浮腫與細胞缺氧；炎性細胞大量吸附與浸潤心肌，造成心肌細胞損傷[11-12]。本研究探討了中藥單體——PD 對LPS 引發(fā)的CMECs 細胞基因表達變化的影響，旨在探討PD 對LPS 引起的CMECs 基因表達變化的影響及分子機制。

圖2 差異基因顯著富集的GO 分析結果（縱坐標為差異基因的功能名稱，橫坐標為P 值的負對數(shù)（-LgP），其值越大表明P 值越小，亦即該差異基因功能顯著性水平越高）

圖4 熒光定量PCR 驗證相關基因的表達差異（與LPS 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

人參是一種傳統(tǒng)的中藥材，對其有效成分人參皂苷（Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rh2 及Rg3 等）的藥理作用已經有了廣泛的研究，它們被證明在心血管疾病方面發(fā)揮一定的保護作用，能夠拮抗鈣離子通道在心肌缺血和再灌注中發(fā)揮保護作用；并能調整心肌細胞的能量代謝、抵抗心肌炎癥等。Rb1 能夠改善炎癥誘導的動脈粥樣硬化[13]，抑制腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 等炎癥因子的表達；此外，在心肌缺血再灌注損傷中，Rb1、Rb3 和Rd 均能夠減少心臟的梗死面積，降低血清中的肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ（troponinI，cTnI）的水平，從而提高缺血再灌注后的心肌功能[14-16]。PD 分子量極小，更利于機體吸收發(fā)揮藥理活性。但是其在LPS 引起的CMECs 損傷中是否發(fā)揮一定作用及其相關分子機制研究還較少。我們的研究通過RNA-seq 高通量測序技術在CMECs 中系統(tǒng)檢測了PD 對LPS 引起的基因表達改變的影響，根據(jù)RNA-seq 結果可以發(fā)現(xiàn)，PD 處理能夠顯著降低LPS 感染引起的部分基因表達改變，包括一些轉錄因子活性基因、離子通道相關基因、表觀遺傳調節(jié)基因等，其中表達顯著降低的基因主要集中在免疫相關信號通路（IL-17、PI3K-Akt、MAPK 信號通路等）、表觀遺傳通路以及CMECs 細胞代謝相關通路（膽堿、甘油磷脂代謝等），說明PD 可以抑制炎癥反應，可能對LPS 引起的CMECs 炎癥反應發(fā)揮抑制效應。此外，PD 能夠顯著改變表觀遺傳相關基因的表達，如組蛋白H3-K4 三甲基化修飾酶等，我們推測它可能通過影響表觀遺傳酶，調控轉錄活性影響炎癥等相關基因的表達。

本研究結果對于揭示PD 的作用機制和作用靶點，以及對心血管內皮細胞基因表達的影響提供了系統(tǒng)性的實驗基礎，可能為臨床上革蘭陰性菌感染的治療提供一定的理論依據(jù)。