陳懌，邱嘉玲，丁程佳，陳加弟，劉志峰，童華生★，江東新★

1東莞市濱海灣中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東東莞 523900；2暨南大學醫(yī)學部，廣州 510632；3南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學科/解放軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復重點實驗室，廣州 510010

中暑是由高溫誘發(fā)的全身炎癥反應 (systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常為突出表現(xiàn)的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1]，在我國南方地區(qū)夏秋季節(jié)極為常見，嚴重危害人民群眾的健康與安全[2]。重癥中暑是中暑的極危重類型，臨床上往往采取積極的全身降溫和臟器支持等救治措施，但其病死率仍居高不下[3]。隨著全球氣候變暖及熱浪襲擊強度和頻率的增加，重癥中暑病死率呈逐年升高的趨勢，即使在華北和東北等高緯度地區(qū)亦頻發(fā)重癥中暑致死事件[4]。呼吸系統(tǒng)是中暑常見的首發(fā)打擊器官，常表現(xiàn)為以呼吸功能障礙為主的急性肺損傷[5]，加之血管通透性增加、液體復蘇不當?shù)纫蛩氐淖饔?，約45%的中暑患者會出現(xiàn)肺水腫、肺損傷，甚至進展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，炎性損傷和氧化應激是重癥中暑啟動并加劇急性肺損傷的主要病理機制[7-8]，且可能與全身或局部的巨噬細胞活性過度強化及其表面的髓樣細胞觸發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)過度表達有關[9-10]。目前研究認為，在固有免疫系統(tǒng)中起核心作用的單核-巨噬細胞與全身炎癥及外周組織器官損傷密切相關[11]。有循證證據(jù)顯示，單核-巨噬細胞活性功能異常與肺組織炎性損傷程度密切相關[12]，提示重癥中暑后單核細胞TREM-1活性功能異?？赡苁羌毙苑螕p傷的重要細胞分子機制，但目前國內外尚未見相關報道。本研究建立中暑大鼠模型并給予TREM-1抑制劑預處理，以期探討特異性抑制TREM-1活性對調控重癥中暑大鼠急性肺損傷的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 TREM-1抑制劑LP-17購自美國Sigma公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒均購自武漢基因美生物科技有限公司；大鼠CD14流式抗體、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)免疫組化抗體、TREM-1流式抗體和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1) Western blotting抗體均購自美國R&D公司；TREM-1 Western blotting抗體購自英國Abcam公司。LSRFortessa流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 實驗動物及分組 SPF級健康成年雄性Wistar大鼠40只，體重200～250 g，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供，喂養(yǎng)于溫度(22±1) ℃和濕度50%±5%的環(huán)境中。實驗前禁食2 h、禁水6 h。本實驗動物處置流程獲得東莞市濱海灣中心醫(yī)院倫理委員會審核批準，符合單位及國家有關實驗動物管理和使用規(guī)定。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組(Con組)、中暑組(HS組)、低劑量抑制劑組(LD組)和高劑量抑制劑組(HD組)，每組10只。

1.3 模型建立及藥物處理 LD組、HD組大鼠分別于造模前2 h經(jīng)尾靜脈注射50 mg/kg、100 mg/kg LP-17試劑。Con組大鼠置于室溫24 ℃環(huán)境下觀察100 min，HS組、LD組和HD組大鼠置于人工氣候艙內[溫度(40±2) ℃、濕度65%±5%]接受高溫高濕打擊60 min，制備經(jīng)典中暑模型。根據(jù)本課題組的前期研究結果，非麻醉狀態(tài)下生活型中暑大鼠造模成功時間為85～90 min[13]，故本實驗在熱應激后80 min頸椎脫臼處死大鼠，采集下腔靜脈血8 ml行ELISA和流式細胞術檢測，取左肺行組織學觀察和免疫組化分析，右肺經(jīng)低溫充分研磨后獲得組織勻漿上清行ELISA和Western blotting檢測。

1.4 方法

1.4.1 ELISA法測定炎性因子的表達水平 采用ELISA法測定血清和肺組織勻漿上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平，實驗步驟參見試劑盒說明書。以空白孔調零，反應終止后于450 nm波長處測定吸光度(OD)值，根據(jù)標準曲線方程計算炎性因子的表達水平。

1.4.2 流式細胞術檢測單核細胞TREM-1的表達采用CD14流式抗體(2.5 μg/106個細胞)標記全血中的單核細胞，加入TREM-1流式抗體(0.25 μg/106個細胞)標記目的表面分子，在488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長條件下，進行流式細胞檢測，計算細胞計數(shù)和百分數(shù)。

1.4.3 肺組織病理學觀察 肺組織切片行HE染色，隨機編碼，由病理學醫(yī)師于光學顯微鏡下行盲法病理損傷評分，具體標準參照文獻[14]，根據(jù)肺泡炎性浸潤、血管周圍炎性浸潤、間質炎性浸潤、肺水腫和肺泡出血等5類病理損傷程度分別給予0～3分(輕度、中度、重度)賦值，每個玻片觀察10個視野，記錄平均值。

1.4.4 免疫組化法檢測iNOS蛋白的表達 肺組織切片經(jīng)抗體(1:50)孵育、顯色、復染、脫水、透明和封固等處理，利用光學顯微鏡觀察和Image Pro Plus 6.3軟件進行分析，測定免疫陽性產(chǎn)物的OD值，免疫反應產(chǎn)物的OD值除以背景OD值得到校正的相對OD(COD)值，即為iNOS免疫陽性產(chǎn)物的實際OD值。

1.4.5 Western blotting檢測TREM-1和MCP-1蛋白的表達 肺組織經(jīng)細胞裂解、轉膜、TREM-1抗體(1:1000)和MCP-1抗體(1:500)孵育、洗膜和定影等流程，利用凝膠成像分析儀分析，以目標條帶和內參條帶的灰度值比值作為蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較若方差齊則采用LSD-t檢驗，若方差不齊則采用Dunnett T3非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 抑制TREM-1可抑制中暑后體循環(huán)血和肺組織中炎性介質的釋放 ELISA檢測結果顯示，與Con組比較，接受熱應激的HS組、LD組和HD組大鼠體循環(huán)血和肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平均明顯升高(P<0.01)。經(jīng)TREM-1抑制劑預處理的LD組、HD組大鼠體循環(huán)血和肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平均低于HS組，且HD組低于LD組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01，圖1)。

圖1 各組大鼠體循環(huán)血和肺組織中炎性介質水平比較Fig.1 Comparison of the levels of inflammatory mediators in the circulating blood and lung tissues of rats in each group

2.2 抑制TREM-1可抑制中暑后體循環(huán)血中單核細胞TREM-1的異常表達 流式細胞術檢測結果顯示，與Con組比較，接受熱應激的HS組、HD組和LD組大鼠體循環(huán)血單核細胞中TREM-1的表達均明顯增加(P<0.01)。經(jīng)TREM-1抑制劑預處理的HD組和LD組大鼠體循環(huán)血單核細胞中TREM-1的表達少于HS組，且HD組少于LD組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01，圖2)。

2.3 抑制TREM-1可減輕中暑后肺組織損傷 HE染色顯示，Con組大鼠可見正常肺泡和毛細血管等結構，肺泡無滲出或出血，肺間質無充血、水腫或炎癥浸潤；HS組大鼠肺組織可見彌漫性肺泡滲出和出血，肺間質腫脹增厚伴大量炎性細胞浸潤，大量肺泡毛細血管淤血伴局部血栓形成；LD組大鼠肺泡出血和毛細血管淤血仍較顯著，但肺間質滲出較HS組有明顯減輕；HD組大鼠肺組織可見肺間質滲出和炎性浸潤，肺泡出血和血管淤血等病理性改變較少。光鏡下肺組織病理損傷評分結果顯示，熱應激后HS組、HD組和LD組大鼠肺組織損傷評分均明顯高于Con組(P<0.01)，HS組高于LD組(P<0.05)和HD組(P<0.01)，LD組高于HD組(P<0.01，圖3)。

2.4 抑制TREM-1可緩解中暑后肺組織的氧化應激 免疫組化染色結果顯示，Con組大鼠肺組織未見明顯的iNOS表達；HS組可見多處大面積iNOS表達，呈棕褐色，多見于肺間質和肺泡上皮細胞等，伴肺泡結構大量破壞；LD組和HD組iNOS表達較HS組明顯減少。統(tǒng)計結果顯示，熱應激后各組大鼠肺組織iNOS的COD值均高于Con組(P<0.01)，HS組高于LD組(P<0.01)和HD組(P<0.01)，LD組高于HD組(P<0.01，圖4)。

圖2 各組大鼠體循環(huán)血單核細胞中TREM-1的表達水平比較Fig.2 Comparison of expression for TREM-1 on the monocytes in the systemic circulation of the rats in each group

圖3 各組大鼠肺組織病理學變化和損傷評分情況(HE ×200)Fig.3 The histological investigation and scores for the rats' lung in each group (HE ×200)

圖4 各組大鼠肺組織iNOS表達比較Fig.4 Comparison of expression of iNOS in lung tissue of rats in each group

2.5 抑制TREM-1可抑制中暑后肺組織中TREM-1和MCP-1的異常表達 Western blotting檢測結果顯示，與Con組比較，中暑可導致大鼠(HS組)肺組織中TREM-1和MCP-1蛋白表達水平異常升高(P<0.01)。給予TREM-1抑制劑預處理后，HD組和LD組大鼠肺組織中TREM-1和MCP-1蛋白表達水平均降低(P<0.05)，其中HD組2種蛋白表達水平均低于LD組(P<0.01，圖5)。

圖5 各組大鼠肺組織中TREM-1和MCP-1表達比較Fig.5 Comparison of expression of TREM-1 and MCP-1 protein in lung tissue of rats in each group

3 討 論

近年來，我國夏季常出現(xiàn)嚴重的極端高溫天氣，使重癥中暑成為高溫氣候環(huán)境威脅群眾健康與生命的常見疾病。目前普遍認為，重癥中暑是由高溫高濕氣候因素誘發(fā)的、以炎癥失控與凝血紊亂為突出表現(xiàn)的MODS，以其發(fā)病機制為基礎、以防治多器官功能損傷為目的的中暑診治策略成為繼快速降溫后重癥中暑救治的“第二關鍵點”[15]。中暑極易并發(fā)肺損傷，且重癥中暑并發(fā)ARDS的發(fā)病率高達23%，一旦發(fā)生ARDS，病死率可達75%。炎性損傷與凝血障礙是中暑向ARDS進展的關鍵的病理生理基礎[16]。非臨床研究發(fā)現(xiàn)，調控SIRS的廣度和嚴重程度可緩解重癥中暑引起的急性肺損傷[17-19]，但在臨床研究中卻未達到改善主要臨床結局的目的[9]，原因可能與未對啟動肺損傷的上游機制或核心環(huán)節(jié)進行干預有關。鑒于有循證依據(jù)顯示單核-巨噬細胞在啟動并加重膿毒癥急性肺損傷中起重要作用[20]，同時體外研究發(fā)現(xiàn)TREM-1表達異?？赡苁侵匕Y中暑單核細胞活性功能異常的關鍵蛋白分子基礎[21]，筆者推測特異性調控單核-巨噬細胞TREM-1的活性可減輕重癥中暑急性肺損傷。本研究從全身和局部炎性介質水平、組織學觀察、氧化損傷程度及趨化因子表達等方面探討調控單核-巨噬細胞TREM-1活性減輕重癥中暑急性肺損傷的效果。

LP-17多肽是高選擇性的TREM-1抑制劑，主要用于調控單核-巨噬細胞功能活性的相關研究[22]。本研究在大鼠中暑造模前給予不同劑量的LP-17預處理，梯度式抑制單核-巨噬細胞TREM-1的活性，結果顯示，不同劑量的TREM-1抑制劑均可下調中暑后單核-巨噬細胞TREM-1的表達水平；抑制TREM-1活性均可有效抑制重癥中暑體循環(huán)血及肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平的異常升高。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β和IL-6等經(jīng)典炎性介質水平的變化與重癥中暑肺損傷嚴重程度具有相關性，抑制上述炎性介質的生成有利于減輕中暑引起的急性肺損傷[7]。結合本研究結果，提示調控單核-巨噬細胞TREM-1活性減輕重癥中暑急性肺損傷的潛在機制之一是抑制全身和局部的炎癥反應。

為了更直觀地觀察調控TREM-1活性對重癥中暑急性肺損傷的作用效果，本研究對肺組織切片行HE染色觀察和病理損傷評分，發(fā)現(xiàn)TREM-1抑制劑濃度越高，緩解中暑后肺損傷的效果越明顯。為了進一步了解其肺保護作用的機制，本研究對肺組織切片行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)抑制TREM-1活性減少了中暑后肺組織iNOS的表達。iNOS是中暑導致組織器官炎癥和氧化損傷的重要介質[23]，其局部組織表達水平與氧化損傷程度直接相關，下調其在肺組織中的表達有利于緩解急性肺損傷[24]。因此，本研究結果證實調控單核-巨噬細胞TREM-1活性減輕重癥中暑急性肺損傷的潛在機制之一是緩解肺組織的氧化損傷。

MCP-1具有誘導單核細胞向巨噬細胞分化、增強單核-巨噬細胞活性并促進其黏附游走的作用[25]。本研究采用Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，中暑后肺組織MCP-1表達明顯上調，而抑制TREM-1活性可下調其表達水平，提示調控單核-巨噬細胞TREM-1的活性減輕重癥中暑急性肺損傷的潛在機制之一是下調MCP-1的過表達。

綜上所述，本研究結果提示單核-巨噬細胞表面的TREM-1在重癥中暑所致器官功能損傷中具有重要作用，為深入探討并完善重癥中暑向MODS發(fā)生發(fā)展的機制提供了理論依據(jù)，即調控單核-巨噬細胞TREM-1活性可通過下調循環(huán)血和肺組織中TREM-1的表達，進而減輕炎性損傷、緩解氧化應激和抑制趨化因子的釋放等機制減輕重癥中暑的急性肺損傷。此外，本研究僅使用了TREM-1活性抑制劑，為了更全面地闡釋單核-巨噬細胞TREM-1在重癥中暑器官損傷病理機制中的作用，后續(xù)可利用基因敲除或基因沉默的方法進一步深入研究。