王彥朝

(鶴壁市傳染病醫(yī)院 檢驗科，河南 鶴壁 458000)

肺結核屬多發(fā)病，具有較高的傳染性，早診斷、早隔離、早治療是防控肺結核的關鍵措施。目前臨床診斷肺結核主要采用痰涂片法、結核分歧桿菌培養(yǎng)法等常規(guī)檢測方法，但其陽性檢出率較低，耗時較長，無法實現(xiàn)快速準確篩查，嚴重影響后續(xù)治療，易使接觸者被感染，增加疾病傳播風險[1]。因此，采取有效的檢測方法實現(xiàn)痰涂片陰性肺結核準確快速診斷，加強疾病預防、控制與傳播，是臨床研究的重要課題。隨著醫(yī)學檢驗技術的不斷發(fā)展，分子生物學檢測技術已在多種傳染性疾病診斷中推廣應用，可為痰涂片陰性肺結核診斷提供思路[2]。本研究選取至少3份痰涂片鏡檢抗酸桿菌均顯示陰性的2 067例疑似肺結核患者，旨在研究RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術(simultaneous amplification and testing，SAT-TB)聯(lián)合熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)檢測在痰涂片陰性肺結核診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年4月至2019年4月鶴壁市傳染病醫(yī)院收治的至少3份痰涂片鏡檢抗酸桿菌均顯示陰性的2 067例疑似肺結核患者，其中男1 408例，女659例；年齡20～67歲，平均(46.22±8.97)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2 納入和排除標準納入標準：(1)胸部X線平片顯示異常陰影；(2)存在2周以上低熱、胸痛、咳嗽、咳痰、咯血等臨床癥狀；(3)可行支氣管鏡檢查；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)無法獲取有效肺泡灌洗液標本；(2)精神類疾??；(3)妊娠期或哺乳期女性。

1.3 檢測方法

1.3.1肺泡灌洗液收集 氣管表面麻醉，置入纖維支氣管鏡(奧林巴斯，BF-P60)探測支氣管肺段情況，采用15 mL質(zhì)量濃度為9 g·L-1的NaCl注射液灌洗胸部X線平片顯示病灶部分，利用負壓吸引器回收灌洗液約10 mL于無菌瓶中，送至檢驗科。

1.3.2SAT-TB檢測 加入質(zhì)量濃度為40 g·L-1的NaCl注射液液化灌洗液，液化后取1 mL置于EP管中，離心5 min，棄上清液并進行2次離心，取部分下層沉渣，采用50 μL裂解液進行重懸，超聲破碎15 min，取2 μL置于潔凈微量反應板上制成涂片，采用恒溫熒光檢測儀檢測，所用試劑及試劑盒均由上海仁度提供。

1.3.3FQ-PCR檢測 將SAT-TB檢測中經(jīng)離心獲取的另外一部分下層沉渣進行洗滌，提取DNA及RNA，采用平臺PCR儀以熒光探針法檢測，所用試劑及試劑盒由凱杰生物提供。上述檢驗操作均由同水平高資質(zhì)?？茩z驗人員嚴格按照儀器及試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4 觀察指標以臨床診斷為“金標準”，比較SAT-TB、FQ-PCR單獨與聯(lián)合診斷痰涂片陰性肺結核的準確率。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，準確率以率(%)表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 診斷結果本研究2 067例疑似肺結核患者中，經(jīng)臨床診斷確診為肺結核1 862例，非結核性分歧桿菌肺病51例，肺部感染64例，肺癌23例，胸腔積液15例，其他肺疾病52例；經(jīng)SAT-TB檢測診斷出肺結核1 393例；經(jīng)FQ-PCR檢測診斷出肺結核1 437例；SAT-TB、FQ-PCR聯(lián)合檢測診斷出肺結核1 765例。見表1。

表1 SAT-TB、FQ-PCR單獨檢測和聯(lián)合檢測的診斷結果

2.2 準確率SAT-TB、FQ-PCR聯(lián)合診斷痰涂陰性肺結核的準確率為94.34%(1 950/2 067)，均高于SAT-TB和FQ-PCR單獨診斷的準確率[77.07%(1 593/2 067)、78.62%(1 625/2 067)](χ2=251.622、218.499，P<0.05)。

3 討論

FQ-PCR檢測是指在常規(guī)PCR擴增的基礎上，采用熒光標記探針法定量檢測結核分歧桿菌插入序列片段的檢測方式，可將核酸擴增、光譜、雜交技術相結合，利于準確進行定量分析[3]。FQ-PCR檢測的靶標為DNA，無法區(qū)分病菌活性與感染進程，易產(chǎn)生交叉污染，影響檢測結果。SAT-TB檢測屬核酸檢測技術，檢測靶標為結核分歧桿菌特異的16s rRNA，通過擴增靶標片段，可快速判斷樣本中是否存在結核分歧桿菌[4]。SAT-TB技術通過對RNA進行檢測，可準確區(qū)分病菌活性，且具有易降解、不易污染等特點，但RNA檢測可造成假陰性結果，影響陽性檢出率。

SAT-TB、FQ-PCR兩種檢測方法聯(lián)合應用可相互彌補，可一定程度提高病菌活性、分歧桿菌種類鑒別力，利于臨床快速對疑似肺結核患者進行準確診斷，縮短確診時間，使患者及時得到治療，為疾病診斷與篩選提供有效指標[5]。SAT-TB、FQ-PCR均從痰標本進行檢測，通過收集肺泡灌洗液有利于對無痰患者實施早期快速診斷，使檢測技術具有時效性、簡便性、準確性等優(yōu)點，可直觀反映出標本中是否存在活菌。SAT-TB、FQ-PCR檢測操作時間均較短，與臨床常用涂片熒光染色相比，可將檢測時間從1 d以上縮短至約1.5 h，利于實現(xiàn)痰涂片陰性肺結核快速有效診斷。本研究結果顯示，SAT-TB、FQ-PCR聯(lián)合診斷痰涂陰性肺結核的準確率為94.34%，均高于SAT-TB、FQ-PCR單獨檢測(P<0.05)。這說明聯(lián)合檢測可提高痰涂陰性肺結核準確率，具有較高的臨床應用價值。SAT-TB檢測中有5例假陽性結果，分析其原因可能為收集肺泡灌洗液時支氣管鏡消毒不嚴或標本運輸時受到污染等原因導致，應加強關注，采取有效應對措施，避免臨床應用時對診斷結果造成不良影響。

綜上，SAT-TB聯(lián)合FQ-PCR檢測診斷痰涂片陰性肺結核的準確率較高，可實現(xiàn)疾病早期快速診斷，使患者及時得到治療，有助于控制肺結核的傳播。