劉絮影林 鵬于小玲

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，山東 青島 266021；2臨沂市精神衛(wèi)生中心，山東 臨沂 276002)

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，死亡率較高[1]。近年來，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)的表達(dá)異?？赡軙?huì)引起乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，但此研究目前尚處于起步階段[2]。有報(bào)道指出，HOTAIR幾乎參與了腫瘤的全部生理、病理方面的改變[3]。本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)HOTAIR在不同乳腺癌患者組織及各細(xì)胞系中的含量，探討其表達(dá)量與疾病發(fā)生及其他病理特征之間的潛在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月—2018年5月在臨沂市腫瘤醫(yī)院就診的64例乳腺癌患者，其年齡、性別、組織學(xué)類型及臨床分期等見表1。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的處理 手術(shù)取乳腺癌組織及周圍正常組織。乳腺腫瘤的新鮮組織塊(直徑大約為1.2 cm)用少許1×PBS或者生理鹽水浸泡洗滌，切一小塊用于多聚甲醛固定，其他組織塊裝入凍存管，標(biāo)記日期和來源，在液氮中進(jìn)行速凍并保存。全部患者的樣本在術(shù)前均未接受放療以及化療處理。

人類乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7、SKBR3、MDA-MB-231、T47D、BT549均購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，人類正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，細(xì)胞在含有10%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)以及每毫升100 U青霉素和每毫升100μg鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、37℃濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2RNA提取及測(cè)定 用RNA提取試劑盒，按照說明書從-80℃保存的組織中提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)cDNA，反應(yīng)體系體積為20μl。RT-PCR反應(yīng)條件：51℃ 2 min，95℃ 10 min預(yù)變性，循環(huán)40次95℃ 30 s變性，60℃持續(xù)45 s退火。qRT-PCR引物序列如下：HOTAIR：(forward)5′-TGTAGATAAAGCAACCACGACGC-3′；(reverse)5′-ACATAAACGTCTGTCTGTGAGTGCG-3′。GAP-DH：(forward)5′-CGAGCCACATCGCTCAGACA-3′；(reverse)5′-GTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3＇。乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7、SKBR3、MDA-MB-231、T47D、BT549)以及人正常乳腺細(xì)胞系 MCF-10A中總RNA的提取及測(cè)定同上，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀其降解情況。

1.2.3數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析，應(yīng)用2-△△CT方法得到相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果之后，對(duì)其相對(duì)定量分析，然后選擇U6作為內(nèi)參，標(biāo)準(zhǔn)化處理全部的樣本HOTAIR基因表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1HOTAIR在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 電泳分析顯示：MCF-10A、SKBR3、MDA-MB-231、MCF-7、BT549及T47D RNA 28s、18s、5s三條帶，且亮度的比例分別為4∶2∶1，表明抽提出的RNA沒有降解，可以用于定量實(shí)驗(yàn)。HOTAIR表達(dá)情況：與正常細(xì)胞系相比，HOTAIR在上述乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)，其中在BT549和SKBR3中表達(dá)量最低，在MDA-MB-231中表達(dá)量最高，在MCF-7細(xì)胞系的表達(dá)量適中，可用于后續(xù)功能研究。見圖2。

2.2HOTAIR在乳腺癌組織中的表達(dá)情況 HOTAIR在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于相鄰正常組織(P<0.05)，見圖3。

2.3HOTAIR表達(dá)量在乳腺癌中的臨床意義 根據(jù)HOTAIR在乳腺癌組織中的表達(dá)水平，將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。統(tǒng)計(jì)分析顯示：HOTAIR表達(dá)與性別、年齡、民族等無顯著相關(guān)性；與分化程度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。見表1。

表1 HOTAIR表達(dá)量與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

多數(shù)乳腺癌是在晚期階段診斷的，此時(shí)腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散到遠(yuǎn)處的器官，而臨床并沒有有效的治療方法。因此，探討乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制對(duì)于其臨床治療和預(yù)防具有重要意義。

乳腺癌是一種多因素疾病，涉及致癌通路和表觀遺傳異常的異常調(diào)控。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是指長度大于200個(gè)堿基、不具備明顯的開放閱讀框(ORF)的RNA分子，它們?cè)诖蠖鄶?shù)情況下通過影響編碼蛋白基因上游啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)。目前為止，人們發(fā)現(xiàn)lncRNAs功能涉及到許多方面，如參與X染色體的失活、調(diào)控mRNA的降解及轉(zhuǎn)錄、核內(nèi)運(yùn)輸、構(gòu)成細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)的骨架、作為染色質(zhì)重塑的調(diào)控因子等，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，例如細(xì)胞增殖、分化和癌變。HOTAIR是近年來發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，它在基因調(diào)控和染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)方面起著重要作用，在多種癌癥中表達(dá)失調(diào)，且在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。對(duì)HOTAIR調(diào)節(jié)癌癥的分子機(jī)制進(jìn)行研究有助于揭示乳腺癌耐藥性、復(fù)發(fā)的根本原因，為乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

本研究測(cè)量了64個(gè)乳腺癌樣本和相鄰正常組織樣本以及多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺細(xì)胞系中HOTAIR的表達(dá)水平。結(jié)果表明，HOTAIR在乳腺癌樣本及多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)均上調(diào)。這表明HOTAIR可能參與乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展的調(diào)節(jié)。

綜上所述，長鏈非編碼RNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA HOTAIL與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有密切的相關(guān)性，對(duì)其在乳腺癌組織或者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)檢測(cè)和深入研究具有一定的理論和臨床指導(dǎo)意義。