張蓓，答秀維，張樂，蘭飛

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院唐都醫(yī)院1疼痛科，2腫瘤科，西安7100380

原發(fā)性肝癌是臨床中常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率極高，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。原發(fā)性肝癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為其與病毒性肝炎、肝硬化、遺傳等因素有關(guān)[1-3]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可在第一時(shí)間對(duì)有害細(xì)胞的刺激做出反應(yīng)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[4-5]。膽固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的二次跨膜蛋白，可促進(jìn)機(jī)體代謝，調(diào)控膽固醇合成[6]。研究表明，NFκB、SREBP2 與多種腫瘤的生存、增殖、轉(zhuǎn)移、黏附和侵襲密切相關(guān)[7]。本研究探討了原發(fā)性肝癌組織中NF-κB 和SREBP2 的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015 年1 月至2017 年1 月空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院唐都醫(yī)院收治的原發(fā)性肝癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)或穿刺活檢病理確診為原發(fā)性肝癌；②生存時(shí)間＞6 個(gè)月；③臨床資料完整；④TNM 分期為Ⅰ～Ⅲ期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并器官衰竭等嚴(yán)重疾??；③出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④術(shù)前已進(jìn)行化療或放療。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入74 例患者。74 例患者中，男42 例，女32 例；年齡31～72 歲，平均年齡（58.41±3.58）歲；腫瘤數(shù)目：?jiǎn)伟l(fā)62 例，多發(fā)12 例；病理類型：肝細(xì)胞癌50 例，其他24 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期50 例，Ⅲ期24 例。收集74 例原發(fā)性肝癌患者的原發(fā)性肝癌組織74 例和癌旁正常組織（距離腫瘤組織邊緣＞3 cm）46 例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase）法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將肝癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟切片、脫水后，加入100%、95%、85%梯度乙醇各5 min，自來(lái)水沖洗。將切片置于3%過(guò)氧化氫溶液-甲醇中，室溫靜置10 min，蒸餾水沖洗3 min，采用pH 9.0 的乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）緩沖液煮沸20 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，加入一抗（1∶70）室溫放置2 h。顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察NF-κB、SREBP2 的表達(dá)情況，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。Elecsys2010 電化學(xué)發(fā)光分析儀及相關(guān)試劑均購(gòu)自羅氏公司。

1.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

由2 位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行閱片。NF-κB、SREBP2 陽(yáng)性顆粒位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色[8]。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 份，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：＜26%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘，0～1 分為陰性（-），2～4 分為弱陽(yáng)性（+），5～8 分為中等陽(yáng)性（++），9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 隨訪

治療結(jié)束后，以電話隨訪及門診復(fù)診的方式對(duì)74 例原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行2 年隨訪，詳細(xì)記錄兩組患者治療后的總生存時(shí)間（即患者開始治療至隨訪截止或患者死亡的時(shí)間）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗(yàn)；采用Cox 回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肝癌組織和癌旁正常組織中NF-κB、SREBP2 表達(dá)情況的比較

原發(fā)性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 的陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.62%（53/74）和68.92%（51/74），分別高于癌旁正常組織的50.00%（23/46）和47.83%（22/46），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.711，P=0.017；χ2=5.297，P=0.021）。

2.2 不同臨床特征原發(fā)性肝癌患者原發(fā)性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑的原發(fā)性肝癌患者原發(fā)性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型為肝細(xì)胞癌的原發(fā)性肝癌患者原發(fā)性肝癌組織中NF-κB 的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于中/高分化、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)脈管侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、其他病理類型的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.385、25.620、15.661、11.605、10.245，P＜0.05）。低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型為肝細(xì)胞癌的原發(fā)性肝癌患者原發(fā)性肝癌組織中SREBP2 的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于中/高分化、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)脈管侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、其他病理類型的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.894、8.837、10.956、11.663、8.581，P ＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征原發(fā)性肝癌患者原發(fā)性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 的表達(dá)情況

2.3 生存情況的比較

NF-κB 陰性表達(dá)和NF-κB 陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間分別為（30.43±6.23）個(gè)月和（22.25±5.24）個(gè)月，SREBP2 陰性表達(dá)和SREBP2 陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間分別為（30.17±7.34）個(gè)月和（22.37±5.81）個(gè)月。生存分析顯示，NF-κB 陰性表達(dá)患者的生存情況優(yōu)于NF-κB 陽(yáng)性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.431，P=0.035）；SREBP2 陰性表達(dá)患者的生存情況優(yōu)于SREBP2 陽(yáng)性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.889，P=0.028）。（圖1、圖2）

2.4 原發(fā)性肝癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

圖1 NF-κB陰性表達(dá)（n=21）和NF-κB陽(yáng)性表達(dá)（n=53）原發(fā)性肝癌患者的生存曲線

圖2 SREBP2陰性表達(dá)（n=23）和SREBP2陽(yáng)性表達(dá)（n=51）原發(fā)性肝癌患者的生存曲線

不同性別、年齡、腫瘤直徑原發(fā)性肝癌患者的2 年生存率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。NF-κB 陰性表達(dá)、SREBP2 陰性表達(dá)、中/高分化、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)脈管侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型為其他的原發(fā)性肝癌患者的2 年生存率分別高于NF-κB 陽(yáng)性表達(dá)、SREBP2 陽(yáng)性表達(dá)、低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型為肝細(xì)胞癌的原發(fā)性肝癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

2.5 原發(fā)性肝癌患者預(yù)后影響因素的多因素Cox回歸分析

以單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量，以患者預(yù)后作為因變量進(jìn)行Cox 回歸分析，結(jié)果顯示，NF-κB 陽(yáng)性、SREBP2 陽(yáng)性、低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型為肝細(xì)胞癌均是原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表3）

2.6 NF-κB 與SREBP2 表達(dá)的關(guān)系

NF-κB 陰性原發(fā)性肝癌患者原發(fā)性肝癌組織中SREBP2 的陽(yáng)性表達(dá)率為33.33%（7/21），明顯低于NF-κB 陽(yáng)性患者的83.02%（44/53），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.334，P＜0.01）。（表4）

3 討論

原發(fā)性肝癌具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，盡管現(xiàn)代診療技術(shù)不斷發(fā)展，仍無(wú)法改變患者確診時(shí)間晚、治療后復(fù)發(fā)率高、遠(yuǎn)期療效差的現(xiàn)狀。越來(lái)越多的研究表明，NF-κB 和SREBP2 與腫瘤的發(fā)生具有密切關(guān)系[8-9]。研究報(bào)道，乳腺癌、胃癌、甲狀腺癌、大腸癌中NF-κB 和SREBP2 均有陽(yáng)性表達(dá)[10]。

表2 原發(fā)性肝癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析（n=74）

表3 原發(fā)性肝癌患者預(yù)后影響因素的多因素Cox 回歸分析（n=74）

表4 NF-κB 與SREBP2 表達(dá)的關(guān)系

NF-κB 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，廣泛存在于哺乳動(dòng)物中，可與B 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB 序列特異性結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，活化的NF-κB 能夠上調(diào)細(xì)胞間黏附因子的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移[11-12]。SREBP2 是一種調(diào)控膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，沉默SREBP2 可有效減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的聚集[13]。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織（P＜0.05）；且NF-κB、SREBP2 陽(yáng)性表達(dá)患者的2 年生存率分別低于NF-κB、SREBP2 陰性表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明NFκB 和SREBP2 在原發(fā)性肝癌患者中陽(yáng)性表達(dá)，可能是作為癌基因參與原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展，這一研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[14]。

本研究結(jié)果顯示，低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型為肝細(xì)胞癌的原發(fā)性肝癌患者原發(fā)性肝癌組織中NF-κB 和SREBP2 的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于中/高分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)脈管侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、其他病理類型的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與李曉楓和劉展華[15]報(bào)道的結(jié)果一致。本研究分析了NF-κB、SREBP2 表達(dá)情況與原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NF-κB、SREBP2 陰性表達(dá)患者的生存情況分別優(yōu)于NF-κB、SREBP2 陽(yáng)性表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示NF-κB、SREBP2 與原發(fā)性肝癌患者的預(yù)后具有密切聯(lián)系。分析其原因可能是細(xì)胞受到外源刺激后，活化的NF-κB 和SREBP2 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮其功能。本研究的Cox 回歸分析結(jié)果顯示，NF-κB陽(yáng)性、SREBP2 陽(yáng)性、低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型為肝細(xì)胞癌均是原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。再次證實(shí)了NF-κB、SREBP2 在原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。本研究結(jié)果還顯示，NF-κB 陰性原發(fā)性肝癌患者原發(fā)性肝癌組織中SREBP2 的陽(yáng)性表達(dá)率為33.33%（7/21），明顯低于NF-κB 陽(yáng)性患者的83.02%（44/53），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（χ2=17.334，P ＜0.01）。提 示NF-κB 與SREBP2 的表達(dá)密切相關(guān)，表明SREBP2 可能通過(guò)NF-κB 的激活參與原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NF-κB 和SREBP2 在原發(fā)性肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率較高，NF-κB 和SREBP2 陽(yáng)性表達(dá)患者多合并脈管侵犯、低分化、高TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特征，NF-κB 和SREBP2 陽(yáng)性表達(dá)的原發(fā)性肝癌患者的預(yù)后較差。臨床中檢測(cè)NF-κB 和SREBP2 的表達(dá)情況對(duì)監(jiān)測(cè)原發(fā)性肝癌患者病情、腫瘤轉(zhuǎn)移及評(píng)估預(yù)后具有重要意義。