翟秧秧，師鑫鵬，羅曉勇#

1鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院放療科，河南 洛陽471009

2洛陽市腫瘤臨床診療研究中心，河南 洛陽4710090

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是中國女性主要的腫瘤死亡原因[1]。在中國，乳腺癌的年齡標化死亡率己達5.7/10 萬[2]?，F階段乳腺癌的治療方法主要是手術為主的綜合治療，包括放療、化療、內分泌治療和靶向藥物治療等。研究發(fā)現，Ⅱ～Ⅲ期乳腺癌患者即使接受手術治療或放化療，5 年內仍有60%～70%的患者出現復發(fā)轉移，而遠處轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因之一[3]。目前認為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及腫瘤細胞自身生長優(yōu)勢，細胞間黏附能力降低，細胞骨架重構導致細胞運動、遷移，細胞凋亡、免疫殺傷和腫瘤血管、淋巴管形成等多種因素，加重了其治療難度[4]。因此，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制成為近年來研究的熱點，Krüpple 樣轉錄因子8（Krüppel like factor 8，KLF8）作為具有雙重調節(jié)作用的轉錄因子越來越得到人們的重視。本文就KLF8 的生物學功能及其在乳腺癌中的研究進展做一綜述。

1 KLF8 的生物學功能

Krüppel 樣轉錄因子（Krüppel like factor，KLF）是一類具有鋅指結構（即DNA 結合結構域）的基本轉錄因子，主要參與識別并結合DNA 序列中的CACCC 元件，它能夠結合DNA 中的CC 盒或相關的CACCC 元件，進而調控富含CC 啟動子的基因表達[5-6]。KLF8 與KLF 家族的其他成員結構相似，在羧基端含有3 個保守的C2H2 鋅指結構，在氨基端含有可變的轉錄調節(jié)結構域。此外，KLF8 還通過蛋白相互作用發(fā)揮轉錄調節(jié)功能。

1.1 KLF8 對細胞周期的調節(jié)作用

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一種細胞質蛋白酪氨酸激酶，在整合素介導的信號轉導中具有重要作用[7]。Zhao 等[8]研究分析了FAK信號轉導對細胞周期進程和細胞存活的影響，結果發(fā)現，FAK 可通過調節(jié)細胞周期調控相關基因的表達，進而影響細胞周期進程，而KLF8 基因是FAK 的特異性靶標，其表達受FAK 信號通路的正調控。該研究采用免疫印跡法檢測蛋白表達，結果發(fā)現，KLF8 表達增加可導致細胞周期蛋白D1（cyclin D1）表達水平升高，從而促進細胞從G1期進入S 期，而KLF8-siRNA 可減緩細胞周期進程。該研究還發(fā)現，KLF8 可通過直接結合cyclin D1 啟動子區(qū)域的GT 盒激活其表達。Wei 等[9]研究發(fā)現，KLF8 可以直接結合cyclin D1 啟動子的GT 盒，從而激活其表達，KLF8 的泛素化降低了其介導的G1期細胞周期進程。Yi 等[10]研究發(fā)現，KLF8 在胰腺癌細胞系和組織中呈高表達，敲除KLF8 可導致胰腺癌細胞G2/M 期阻滯，周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）/細胞分裂周期蛋白2（cell division cycle 2，CDC2）、細胞周期蛋白B1（cyclin B1）和cyclin D1 表達下調，而p21 和p27 表達上調。

1.2 KLF8 在血管生成中的作用

研究發(fā)現，在高表達KLF8 的SMMC7721 肝癌細胞中，血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素2（angiopoietin 2，Ang2）、低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）的mRNA 表達水平增加，而VEGF、Ang2、HIF-1α和MMP2 在腫瘤的血管生成中具有至關重要的作用[11-13]。HIF-1α通過結合VEGF 啟動子區(qū)域的低氧反應元件（hypoxic response element，HRE），在乏氧腫瘤細胞中上調VEGF 的表達[14]?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可通過促進腫瘤細胞生長、侵襲、轉移及血管生成而促進腫瘤進展。研究發(fā)現，MMP2 和MMP9 可誘導卵巢癌細胞中VEGF 的釋放[15]。李旭等[11]將KLF8 基因轉染至人肝癌SMMC7721 細胞中，通過定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測細胞中HIF-1α、VEGF、血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）、Ang2、血管生成素受體Tie2 及MMP2 的表達，結果發(fā)現，在肝癌細胞中，KLF8 可能通過調控VEGF、Ang2、HIF-1α、MMP2 的表達來調控血管生成。Cheng 等[16]研究發(fā)現，在肝癌細胞中KLF8 可通過結合血管內皮細胞生長因子A（vascular endothelial growth factor，VEGFA）啟動子的CACCC 區(qū)域，上調VEGFA mRNA 的表達，此外，KLF8 還可以調控HIF-1α的表達。進一步研究發(fā)現，KLF8 在肝細胞癌中可通過調控磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路誘導VEGFA 的表達，進而調控腫瘤血管新生。

1.3 KLF8 在上皮間充質轉化中的作用

上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤細胞從無創(chuàng)狀態(tài)發(fā)展為侵入狀態(tài)的決定性步驟，其主要特征包括細胞黏附分子（如E-鈣黏素）表達減少、細胞角蛋白為主的細胞骨架轉化為波形蛋白（vimentin）為主的細胞骨架及形態(tài)上具有間充質細胞的特征等。為研究KLF8 與腫瘤EMT 的關系，Wang 等[17]在幾乎無內源性KLF8 表達的MDCK 犬腎上皮細胞和MCF-10A 人乳腺上皮細胞中通過逆轉錄病毒轉染KLF8，免疫印跡檢測結果顯示，上皮標志蛋白E-鈣黏素表達降低，間質標志蛋白N-鈣黏素、波形蛋白表達升高，提示KLF8 在MDCK 和MCF-10A 上皮細胞中均可誘導EMT。該研究進一步進行啟動子熒光素酶報告基因檢測，結果發(fā)現，KLF8 通過直接與E-鈣黏素基因啟動子中的GT 盒結合來抑制其表達。

1.4 KLF8 在脂肪細胞分化中的作用

KLF 家族作為含鋅指蛋白的轉錄因子，在細胞分化和增殖中發(fā)揮了重要作用。Lee 等[18]研究發(fā)現，敲除KLF8 基因后可顯著減弱脂肪細胞分化。此外，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和CCAAT/增強子結合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα）作為多效性轉錄激活因子，可協同誘導脂肪細胞特異性基因的表達，從而形成成熟的脂肪細胞。熒光素酶檢測結果顯示，KLF8 過表達誘導了PPARγ和C/EBPα的轉錄活性，說明KLF8是PPARγ和C/EBPα的上游調控因子，提示KLF8 在脂肪細胞早期分化中具有重要作用。KLF 家族的其他成員也被證實在脂肪分化中具有重要作用，如KLF5、KLF6 和KLF15 均被證明能夠促進脂肪形成[19-21]，KLF15 還能夠上調葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）的表達[21]。KLF3、KLF4 在脂肪形成中的作用也已經被證實，其中KLF3 通過招募C-末端結合蛋白（C-terminal binding protein，CTBP）輔助抑制因子抑制脂肪細胞分化[22]，KLF4 基因敲除后阻止了脂肪的分化，但KLF4 并非脂肪分化的必要條件[23]。KLF 家族對脂肪分化的調節(jié)使其在肥胖控制中的作用逐漸引起人們的注意。

2 KLF8 在乳腺癌中的作用

KLF8 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用見圖1。

圖1 KLF8在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

2.1 KLF8 與乳腺癌侵襲和轉移的關系

KLF8 是EMT 和腫瘤侵襲的重要誘導因子，除了通過抑制E-鈣黏素轉錄來誘導EMT，KLF8 對細胞外基質的調節(jié)在腫瘤細胞的轉移過程中也發(fā)揮著巨大的作用。MMP9、MMP14 均是MMP 成員，腫瘤細胞利用MMP 的蛋白酶降解細胞外基質，從而使腫瘤細胞以循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的形式存活下來，并在遠處定植。研究發(fā)現，KLF8 可直接結合并激活人MMP9、MMP14基因啟動子促進其表達，從而促進乳腺癌的侵襲和轉移[24-25]。

上皮基質相互作用蛋白1（epithelial stromal interaction 1，EPSTI1）在侵襲性乳腺癌中高表達。裸鼠實驗表明，EPSTI1 異位表達可使MCF-7 細胞具有乳腺浸潤性生長和肺轉移的能力，EPSTI1 是KLF8 轉錄激活的新靶點，通過激活含纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）依賴性核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）而在乳腺癌的侵襲性生長和轉移中發(fā)揮關鍵作用[26]。C-X-C 型趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）是C-X-C 型趨化因子配體12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）的受體，CXCR4 過表達與乳腺癌的生長和轉移有關[27-29]。研究發(fā)現，在浸潤性乳腺癌中，KLF8 通過直接結合CXCR4 基因啟動子促進其表達，CXCL12 與CXCR4 的結合可導致FAK 激活，而FAK 作為KLF8 的上游誘導因子進一步促進KLF8 的表達，從而形成了正反饋循環(huán)[30]。這些研究結果表明，由KLF8、CXCR4 和FAK 組成的正反饋循環(huán)對促進乳腺癌轉移具有關鍵作用。在乳腺癌中，KLF8 除了通過抑制E-鈣黏素的表達促進EMT，還通過直接結合MMP9、MMP14、EPSTI1、CXCR4 基因啟動子并促進其表達，進而促進乳腺癌的侵襲和轉移。

2.2 KLF8 與乳腺癌細胞干性的關系

腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）是一種具有自我更新、分化能力的腫瘤細胞亞群，被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移、復發(fā)和對各種治療方法產生抵抗的重要原因[31]。Wang 等[32]研究將乳腺細胞干性與腫瘤轉化聯系起來，使用四環(huán)素誘導KLF8 表達的MCF-10A 細胞系，驗證其EMT 特性后，采用流式細胞儀檢測人乳腺干細胞表面標志物CD44 高表達/CD24 低表達情況，結果發(fā)現，當誘導KLF8 的表達時，超過90%的細胞獲得CD44 高表達/CD24 低表達模式，而未誘導KLF8 表達的細胞中只有33%的細胞獲得此模式，提示KLF8 可通過EMT 誘導乳腺細胞干性。此外，因微小RNA（microRNA，miRNA）參與了乳腺細胞干性的調節(jié)[33]，Wang 等[32]還通過檢測過表達KLF8 的細胞中miRNA 的表達譜，發(fā)現miRNA-146a 在浸潤性乳腺癌細胞（MDA-MB-231、Hs578T 和BT-549）中的表達顯著上調，而在非浸潤性乳腺癌細胞（MCF-7 和T47-D）中的表達未上調。進一步研究發(fā)現，miRNA-146a 可能通過抑制Notch 信號抑制物NUMB蛋白的表達，在誘導EMT 和維持乳腺癌細胞干性中發(fā)揮重要作用。

2.3 KLF8 與乳腺癌化療耐藥的關系

在正常細胞分裂的過程中有多種DNA 修復機制來保持基因組的完整性。DNA 損傷對腫瘤細胞的細胞毒性作用使得DNA 損傷劑成為腫瘤治療的主力軍。細胞毒性藥物如多柔比星、環(huán)磷酰胺和柔紅霉素可導致細胞產生DNA 單鏈斷裂（single strand break，SSB），未能修復SSB 將導致DNA 雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。SSB 和DSB 主要由多腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1]和乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）或DNA 依賴性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）修復，細胞中異常高水平的DNA 修復功能不僅可增加對細胞毒性藥物的耐藥性，而且由于DNA 修復不當導致的基因組和染色體不穩(wěn)定性也可能增加細胞的惡性程度。研究發(fā)現，在多柔比星處理的乳腺癌細胞中，KLF8 與PARP-1 和DNA 依賴性蛋白激酶催化亞基（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）相互作用并受其調控，提示KLF8 可能參與SSB 和DSB 修復過程，該研究明確地將KLF8 促進DNA 修復與細胞對多柔比星耐藥聯系起來[34]。

2.4 KLF8 與乳腺癌表皮生長因子受體信號通路的關系

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）常常在侵襲性乳腺癌（如三陰性乳腺癌）中過表達，并與不良預后相關。Li 等[35]研究發(fā)現，在非腫瘤性乳腺上皮細胞系MCF-10A 中，KLF8 的過表達可誘導EGFR 表達，而在侵襲性乳腺癌細胞系MDA-MB-231 中，敲除KLF8 基因可降低EGFR 的表達。啟動子激活和結合實驗發(fā)現，KLF8 可以通過直接結合并激活EGFR 啟動子促進EGFR 的表達，同時KLF8 還可以通過抑制miRNA-141 啟動子，從而抑制其表達；而miRNA-141 可靶向EGFR 的3'非翻譯區(qū)，從而抑制EGFR 的翻譯，即KLF8通過抑制miRNA-141的表達間接促進了EGFR的表達。以上結果提示KLF8-miRNA-141/EGFR信號通路在乳腺癌的惡性進展中具有重要作用。

3 小結與展望

綜上所述，KLF8 作為具有雙重調節(jié)作用的轉錄因子，不僅能夠調節(jié)細胞周期、血管生成、EMT及脂肪細胞分化，還能夠通過促進乳腺癌侵襲和轉移、維持乳腺癌細胞干性、促進化療耐藥及EGFR 表達，進而促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。關于KLF8在乳腺癌中的作用機制還有待進一步研究，且目前尚未有研究針對KLF8 表達與乳腺癌患者臨床特征及預后的關系進行分析，這為下一步的研究提供了思路。