楊文潤(rùn) 莫曉彥 顏林 田勝慧 曹穗蘭 楊立峰 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要：目的：探究兔血漿應(yīng)用于PTT試驗(yàn)以評(píng)價(jià)醫(yī)療器械促凝活性的可行性。方法：以ASTM F2382-04標(biāo)準(zhǔn)為研究基礎(chǔ)，選擇5種醫(yī)療器械或材料，在同一試驗(yàn)條件下，分別使用人血漿和兔血漿進(jìn)行PTT試驗(yàn)。結(jié)果：對(duì)兩種血漿的PTT試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行促凝活性分級(jí)，除玻璃珠組的促凝血活性分級(jí)有差異外，其他4種醫(yī)療器械或材料的促凝活性分級(jí)均為：重度、中度、輕度、極輕。結(jié)論：兔血漿和人血漿的PTT試驗(yàn)具有良好的一致性，當(dāng)人血漿來源不足時(shí)，兔血漿可作為一種比較理想的血漿來源應(yīng)用于PTT試驗(yàn)以評(píng)價(jià)醫(yī)療器械的促凝活性。

一般與血液接觸的醫(yī)療器械都需要進(jìn)行血液相容性評(píng)價(jià)，以保證其臨床使用的安全[1]。血液相容性評(píng)價(jià)的凝血試驗(yàn)類分類中推薦評(píng)價(jià)PTT這個(gè)指標(biāo)[2,3]。由于受限于器械與血液相互作用的認(rèn)識(shí)和其試驗(yàn)的精確度，標(biāo)準(zhǔn)中尚未提供PTT試驗(yàn)的詳細(xì)方法[1,3]。針對(duì)這些情況，本研究對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)進(jìn)行了大量研究。

PTT是指枸櫞酸鈉抗凝的血漿進(jìn)行再鈣化試驗(yàn)時(shí)加入部分凝血活酶后的凝固時(shí)間[1,4]。本研究的PTT試驗(yàn)是基于活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）試驗(yàn)的改良，PTT試驗(yàn)中被測(cè)材料充當(dāng)激活劑[5]。ASTM F2382-04中表明其PTT試驗(yàn)的測(cè)試方法涵蓋、允許評(píng)價(jià)心血管器械材料通過內(nèi)源性凝血途徑誘導(dǎo)凝血的能力，其測(cè)試方法也是醫(yī)療器械血液相容性評(píng)價(jià)的一部分[3,5]。

為了使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有更好的臨床相關(guān)性，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)均優(yōu)先推薦使用人血漿進(jìn)行PTT試驗(yàn)[1,3,5,6]。但目前我國(guó)人血漿主要供應(yīng)于臨床輸血使用，未經(jīng)批準(zhǔn)的私自采血屬于違法行為，檢測(cè)機(jī)構(gòu)開展大批量的PTT試驗(yàn)時(shí)，人血漿很難獲得長(zhǎng)期、穩(wěn)定的供應(yīng)。其次，人血漿可能會(huì)攜帶艾滋、肝炎、流感等傳染性病毒，使用前必須經(jīng)過檢驗(yàn)。再加上PTT試驗(yàn)推薦使用的人血漿要求新鮮，要求使用不超過4h的血漿，所以在日常的檢驗(yàn)工作中長(zhǎng)期大量使用新鮮的人血漿變得極為困難[2,7]。

醫(yī)療器械進(jìn)行血液相容性評(píng)價(jià)時(shí)也常用到家兔、綿羊、狗等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1,3]。相關(guān)研究表明，家兔為醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)中一種常用的動(dòng)物模型，使用家兔動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)醫(yī)療器械的血液相容性也較為成熟，因其血液與人的血液有一定的相近之處[4,7]。與人血漿相比，兔血漿更容易獲取，兔的品系、供應(yīng)也更加穩(wěn)定，健康狀況也相對(duì)容易控制?；谏鲜鲅芯亢拖嚓P(guān)文獻(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)的理論，此次研究擬使用兔血漿和人血漿進(jìn)行PTT試驗(yàn)，對(duì)兔血漿能否用于PTT試驗(yàn)作進(jìn)一步探究[1,2,3,5,6,7]。

1.材料與方法

1.1 一般材料

血漿來源：人血漿由3名健康的志愿者提供；兔血漿采集于3只健康、成年普通級(jí)家兔（來源：廣東省廣州市白云區(qū)龍歸興科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，合格證號(hào)：SCXK（粵）2017-0042（44817200000186））。

試劑耗材：兔腦磷脂凍干粉（北京博爾西科技有限公司，用純水配制成兔腦磷脂懸液[3]）、一次性使用真空采血管（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，管體材質(zhì)為塑料）、3.8%檸檬酸鈉抗凝劑（上海源葉生物科技有限公司）、氯化鈣溶液（希森美康生物科技（無錫）有限公司）、鞣花酸（上海源葉生物科技有限公司）、玻璃珠（海門市俊元實(shí)驗(yàn)器材）。

儀器設(shè)備：全自動(dòng)血凝分析儀（日本希森美康生物科技有限公司，按ASTM F2382-04的要求設(shè)置增加PTT的檢測(cè)項(xiàng)目）、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、去隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 材料制備

使用人血漿試驗(yàn)設(shè)為A試驗(yàn)，使用兔血漿試驗(yàn)設(shè)為B試驗(yàn)。A、B試驗(yàn)各設(shè)6組，每組設(shè)3個(gè)平行管，相同條件制備，將制備好的樣品裝進(jìn)一次性使用真空采血管中，具體如下。

組別1：鞣花酸，用純水配制成10mg/mL懸液，每管加入200μL。

組別2：玻璃珠，直徑約2mm，按5cm2/mL比例，每管加入10cm2。

組別3：導(dǎo)絲，制備成約2.0cm的小段，按0.2g/mL比例，每管加入0.4g。

組別4：顱內(nèi)支撐導(dǎo)管，制備成約2.0cm 的小段，按0.2g/mL比例，每管加入0.4g。

組別5：聚乙烯粒料：直徑約5mm，按5cm2/mL比例，每管加入10cm2。

組別6：陰性對(duì)照組，不添加任何材料。

1.2.2 血漿制備

新鮮抗凝混合人血漿：通過靜脈采血，按血液與抗凝劑9:1的比例加入3.8%檸檬酸鈉溶液抗凝，混勻；然后置于高速冷凍離心機(jī)中，在2000g條件下離心10min；然后分離出貧血小板血漿（PPP）[4]；最后將3名志愿者的血漿混勻，保存在冰浴中，備用。

新鮮抗凝混合兔血漿：通過心臟采血，同法制備兔血漿。

1.2.3 血漿與材料接觸

分別向A試驗(yàn)的所有試管加入2.0mL人血漿，使材料全部被浸沒，B試驗(yàn)同法加入兔血漿。將所有試管輕輕混勻后放進(jìn)隔水式恒溫培養(yǎng)箱的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上，在（37±1）°C條件下，30r/min動(dòng)態(tài)接觸60min。溫育結(jié)束后將各管中的血漿分離到新的試管中，分離后將所有試管置于冰浴中待測(cè)，最后用全自動(dòng)血凝分析儀分別測(cè)定各管血漿的PTT值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)ASTM F2382-04提供的依據(jù)，判斷器械或材料對(duì)血漿的內(nèi)源性凝血途徑是否有活化作用，需要通過試驗(yàn)組中的NC值進(jìn)行判定，結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1.PTT結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

NC值計(jì)算公式：NC(%)=h1/h0

式中：h1為各組的PTT平均值，h0為陰性對(duì)照組中的PTT平均值。

2.結(jié)果

通過計(jì)算得出各組試驗(yàn)結(jié)果的平均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）、變異系數(shù)（CV）、NC值和促凝活性分級(jí)，詳見表2和表3。

3.討論

本研究的試驗(yàn)方法主要參考標(biāo)準(zhǔn)為ASTM F2382-04，同時(shí)也進(jìn)行了改良。血漿在激活過程中，F(xiàn)XII因子的激活是在帶負(fù)電的表面上或者微生物的膜上發(fā)生的一種自激活反應(yīng)，如玻璃、鞣花酸、高嶺土、寅式鹽、硫化的右旋糖苷、磷脂等[9,10]。標(biāo)準(zhǔn)推薦使用玻璃珠作為陽性材料，接觸表面積為4cm2/mL，加入血漿孵育15min[5]。有研究表明，玻璃珠按5cm2/mL的比例加入血漿孵育30min后，血漿的凝血時(shí)間和FⅫ的活化產(chǎn)物更為穩(wěn)定[8]。為使試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性更好，結(jié)合醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的加嚴(yán)浸提原則，研究中各種材料與血漿的接觸比例增大為5cm2/mL，材料與血漿接觸時(shí)間從15min延長(zhǎng)至60min，血漿均采用新鮮混合血漿以減少個(gè)體差異[11]。

表2.A試驗(yàn)結(jié)果(人血漿)

表3.B試驗(yàn)結(jié)果(兔血漿)

鞣花酸和玻璃珠可作為內(nèi)源性凝血途徑的激活劑，APPT試劑中常添加鞣花酸作為激活劑，所以本研究選擇鞣花酸和玻璃珠作為陽性對(duì)照材料[5,9,10]。分析表2、3的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，兩種血漿試驗(yàn)中鞣花酸組和玻璃珠組的NC值均符合標(biāo)準(zhǔn)中陽性材料的要求（NC值要求小于50%），兩種血漿試驗(yàn)中各組的變異系數(shù)（CV）均小于15%，且各管PTT值均在本組均值的±25%范圍內(nèi)[5,12]。所以人血漿和兔血漿進(jìn)行的PTT試驗(yàn)均符合ASTM F2382-04的標(biāo)準(zhǔn)要求，試驗(yàn)體系均成立。

分析表2、3的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，根據(jù)ASTM F2382-04促凝活性的分級(jí)依據(jù)，對(duì)兩種血漿的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行促凝活性分級(jí)，聚乙烯粒料、顱內(nèi)支撐導(dǎo)管、導(dǎo)絲、鞣花酸4種醫(yī)療器械或材料的促凝活性分級(jí)均為：重度、中度、輕度、極輕。雖然玻璃珠組的人血漿和兔血漿的促凝血活性分級(jí)有差異，其原因可能是由于部分凝血活酶對(duì)不同物種的凝血因子的敏感性存在差異，導(dǎo)致同一材料在同一試驗(yàn)條件下使用不同物種的血漿，其PTT值可能有差異，即使是同一血漿測(cè)試不同批次同一物種來源的部分凝血活酶，其PTT值也會(huì)產(chǎn)生差異[13]。但玻璃珠組人血漿和兔血漿的NC值陽性材料劃分是具有一致性的，均小于50%，且其NC值在各組的階梯值位置也是具有一致性的?？梢姴煌牧蠈?duì)人血漿和兔血漿的內(nèi)源性凝血途徑的激活作用有良好的一致性。

綜上所述，此次研究使用人血漿和兔血漿進(jìn)行的PTT試驗(yàn)，基于ASTM F2382-04標(biāo)準(zhǔn)要求的同時(shí)也有所改進(jìn)，其結(jié)果均符合ASTM F2382-04標(biāo)準(zhǔn)的要求，試驗(yàn)體系成立，試驗(yàn)結(jié)果具有良好的一致性。局限于人血的來源和醫(yī)療器械產(chǎn)品的復(fù)雜性，此次研究的器械或材料和數(shù)據(jù)還不夠全面，如未在此次研究中找到對(duì)內(nèi)源性凝血途徑無激活作用的器械或材料。此次研究可為需要長(zhǎng)期進(jìn)行大量日常檢驗(yàn)工作提供一個(gè)可行性選擇，即當(dāng)人血漿來源不足時(shí)，兔血漿可作為一種比較理想的血漿來源，應(yīng)用于PTT試驗(yàn)以評(píng)價(jià)醫(yī)療器械的促凝活性。