張 慧，杜 娟，趙思峰*

(1. 新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，重慶 401329)

【研究意義】枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣、對(duì)環(huán)境和生態(tài)健康安全等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物病害的防治上[1-3]?？莶菅挎邨U菌在生長(zhǎng)過程中能夠產(chǎn)生多種類型的抑菌物質(zhì)，而脂肽類物質(zhì)產(chǎn)生是枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性和較廣抑菌譜的主要原因之一[1-2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)主要分為三大家族：伊枯草菌素(iturins)、表面活性素(surfactins)和豐原素(fengycins)，其中iturin和fengycin家族中的環(huán)狀脂肽能在病原體入侵植物組織之前抑制真菌孢子萌發(fā)[4-5]。iturinA是iturin家族的成員，其抑菌譜廣，對(duì)很多植物病原真菌有很強(qiáng)的抑菌活性，是具有重要開發(fā)價(jià)值的新型生物源農(nóng)藥[6-7]。iturin A操縱子由ituD、ituA、ituB和ituC4個(gè)開放閱讀框組成，其中ituD基因編碼編碼丙二酰CoA轉(zhuǎn)?；福摶虻娜狈?dǎo)致iturin A合成明顯不足[8-10]。iturin A的合成量與芽孢桿菌菌株對(duì)植物病害的生物防治效果密切相關(guān)[4,11]。 iturin家族中的環(huán)狀脂肽也參與群集運(yùn)動(dòng)、生物膜形成以及菌落形態(tài)。群集動(dòng)力和生物膜形成是芽孢桿菌菌株在新環(huán)境中主要適應(yīng)性定植策略[12-14]。 PCR和qRT-PCR已被用于研究參與iturin合成的基因表達(dá)和抗真菌活性的影響[10,14-15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】B.subtilisS44分離自新疆棉田土壤，該菌株對(duì)幾種土傳病害有良好的防病效果[16]，同時(shí)從S44菌株中克隆到了與 iturin A合成密切相關(guān)的ituD基因[17-18]。前人對(duì)ituD基因多是對(duì)其進(jìn)行敲除并驗(yàn)證其抑菌活性[8-10]，對(duì)其敲除后定殖能力的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用抗生素標(biāo)記法，研究野生菌株與ituD基因缺失株S1[19]在土壤中的定殖存活能力，并比較分析ituD基因在野生菌株和缺失菌株中的表達(dá)量及其在抗菌物質(zhì)iturin A的生物合成的功能，為進(jìn)一步了解該菌株的防病機(jī)制和生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 棉花立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)和B.subllisS44由石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。B.subtilisS1為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建ituD基因缺失突變菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，pH 7.0，H2O 1000 mL；NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.2，H2O 1000 mL。

1.1.3 供試土壤 供試土壤為砂質(zhì)壤土，土壤過1 mm篩后于烘箱中160 ℃高溫滅菌 2 h，冷卻后備用。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性檢測(cè) 參照Yoshida等[20]方法。以立枯絲核菌作為檢測(cè)菌株，取培養(yǎng)48 h的野生株S44和突變株S1菌液，接于距菌餅2.0 cm處，以無菌LB培養(yǎng)液為對(duì)照，對(duì)抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 RT-PCR 將野生型S44、突變體S1接種于50 mL的LB培養(yǎng)液中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.0。按照TaKaRa公司細(xì)菌RNA提取試劑盒以及反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法提取細(xì)菌總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以野生型S44和突變體S1的cDNA為模板，以引物ituD-R：5′-TGAAGAGGCGAGCGATGCTAT-3′，ituD/F：5′-GCTATGACCTGCCAGAAAGTGC-3′進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)ituD基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。反應(yīng)試劑使用TAKARA的SYBR Premix EX TagTM II kit (TaKaRa)，儀器為Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR system。選取rpsJ作為內(nèi)參基因[21]，上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 菌株抗性標(biāo)記 將S44菌株在LB平板上活化后，挑取單菌落轉(zhuǎn)入含5 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，然后在含有5 μg/mL氨芐青霉素LB 平板上劃線培養(yǎng)，將單菌落依次經(jīng)含有 10、20、50、100 μg/mL氨芐青霉素培養(yǎng)基誘導(dǎo)，直至篩選出穩(wěn)定的抗性的突變菌株，挑選能穩(wěn)定生長(zhǎng)且保留原始功能的標(biāo)記菌株[22]，并命名為S44-A。

1.2.4 盆栽試驗(yàn) 試驗(yàn)在石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)站溫室內(nèi)進(jìn)行，供試菌株(S44-A、S1)分別活化后置于 LB 培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)48 h，供試作物為棉花。取滅菌后試驗(yàn)土，裝入培養(yǎng)缽中，每缽種20粒種子，播種后每 2 d澆施無菌水，保持棉花正常生長(zhǎng)狀態(tài)。試驗(yàn)處理如下：S44-A和R.solani同時(shí)接種；S1和R.solani同時(shí)接種；只接種R.solani病原菌；只接種無菌水對(duì)照。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。自然條件下室內(nèi)培養(yǎng)，14 d后，調(diào)查并記錄各處理的棉苗株高、干重和發(fā)病率。

1.2.5 標(biāo)記菌株在棉花根際定殖 在種植第0、3、14天，收集S44-A和S1處理棉花根際土壤5 g，加入到45 mL無菌水中，室溫下140 r/min振蕩30 min，85 ℃水浴30 min后分別按1×10-6、1×10-7和1×10-8梯度稀釋，將稀釋液分別涂布于含5 μg/mL四環(huán)素和含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后對(duì)細(xì)菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6 土壤中iturinA的量測(cè)定 在種植第0、3、14天，分別取S44-A和S1處理的根際土壤3 g，懸浮于21 mL的乙腈和3.8 mM的三氟乙酸(4∶1，v/v)的混合物中，室溫140 r/min振搖1 h。使用滅菌濾紙除去土壤，將濾液烘干。所得的沉淀物用2 mL的甲醇萃取2 h，萃取液以13 525 r/min離心2 min，通過0.22 μm的小孔過濾器，濾液注入HPLC柱(Lichrospher C18, 250 9 4.6 mm，Agilent Technologies Corporate)，USA)。然后在Waters 2695 HPLC系統(tǒng)上以0.9 mL/min的流速操作。使用乙腈和10mM乙酸銨(35∶65，v/v)的混合物作為洗脫液，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，具體方法參考文獻(xiàn)[9,23]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 利用 Microsoft Excel 2010 和 SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及制圖，采用單因素方差分析法分析各組數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ituD基因表達(dá)和抑菌活性檢測(cè)

通過對(duì)基因缺失后的ituD相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株S44相比，ituD基因在S1菌株中幾乎不表達(dá)。將S1與S44-A的抗真菌活性進(jìn)行比較(圖2)，與S44相比，S1(圖2-A和2-B)顯示沒有抗真菌活性(圖2-D)，表明ituD基因破壞導(dǎo)致iturin A缺乏。

圖1 芽孢桿菌菌株的ituD基因表達(dá)Fig.1 Gene expression of ituD by Bacillus strains

C為對(duì)照；A、B 為S1發(fā)酵液的粗提物；D為S44發(fā)酵液的粗提物處理C indicated as control; A and B indicated the supernatants of fermentation from S1 strains;D indicated the supernatants of fermentation from S44 strains

2.2 S44-A和S1防治效果

如表1所示，在未加R.solani的處理土壤中，所有的棉花種子均能正常生長(zhǎng)，且沒有病害發(fā)生。R.solani的處理的土壤中，植物的發(fā)病率為94.9 %，株高和干重都明顯的低于未加R.solani的處理。S44-A處理的種子發(fā)病率為26.1 %，株高比加R.solani處理低1.7 %，干重比加R.solani處理高21 %；株高比未加R.solani處理低24 %，干重比未加R.solani高25 %；株高比S1處理低1.2 %，干重比S1處理高26 %。S1處理的種子，株高和干重比加R.solani分別低0.5 %和3.6 %，發(fā)病率為95 %，與對(duì)照沒有顯著差異。

表1 菌株對(duì)棉苗立枯病的防治效果

2.3 菌株在土壤存活量檢測(cè)

由表2可知，經(jīng)S44-A和S1處理后的棉苗，土壤菌株生物量均下降，0～3 d下降速率較緩，在第14天，S44-A處理土壤生物量降低較為緩慢，而S1處理土壤菌株生物量下降較為迅速，僅有51.5，可能是由于ituD的缺失使菌株S1不能以孢子的形態(tài)穩(wěn)定的在土壤中存活。盡管土壤最初是經(jīng)過滅菌處理，但是盆栽實(shí)驗(yàn)是露天進(jìn)行，土壤暴露在空氣中，許多因素都會(huì)影響細(xì)菌的存活數(shù)量。但是這些因素對(duì)S44-A的細(xì)菌數(shù)量的影響相對(duì)較小。

表2 土壤中菌落數(shù)

2.4 土壤中iturinA的量

由表3可知，經(jīng)S44-A處理后，采集根際土壤進(jìn)行iturin A檢測(cè)，在種植后，檢測(cè)出土壤中iturin A的量為13.54 μg/g，隨著時(shí)間推移，iturin A的量逐漸減少，在第14天仍能檢測(cè)到少量的iturin A，由于土壤中S44-A存活量的減少，iturin A也逐漸減少。然而，在S1處理中土壤中均沒有檢測(cè)到iturin A。

表3 土壤中iturin A的濃度

3 討 論

在細(xì)菌中，對(duì)于某個(gè)特定基因的功能研究一般要構(gòu)建突變株來進(jìn)行比較研究。以往的研究表明，相關(guān)基因表達(dá)量、抗菌脂肽類物質(zhì)的合成、菌落活性與其對(duì)植物病害的抑制作用密切相關(guān)[10,14-15,24]。因此，本研究是通過比較野生型S44和基因缺失突變株S1來分析ituD的功能。通過對(duì)野生菌S44和S1菌株的比較發(fā)現(xiàn)，ituD基因缺失后，與野生型相比，S1菌株沒有抑菌活性，這表明ituD基因缺失導(dǎo)致iturin A的減少，致使S44菌株沒有抑菌活性。與野生型相比，在突變體菌株S1中ituD基因幾乎不表達(dá)。

生防治劑通常通過施用于土壤中，因此根際定植能力和菌株的存活量是生物防治的先決條件。通過梯度法篩選出對(duì)氨芐青霉素抗性較高的菌株，為后期菌株定殖與存活研究提供基礎(chǔ)。本研究中篩選氨芐青霉素抗性菌株，為驗(yàn)證其生物學(xué)功能，我們進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在R.solani的處理的土壤中，S44-A處理的發(fā)病率為26.1 %，與野生菌株[17]發(fā)病率相當(dāng)，完全可以應(yīng)用于后續(xù)研究。

B.subtilis能夠以孢子的形態(tài)穩(wěn)定的在土壤中存活，這是該細(xì)菌成為生物防治劑的優(yōu)點(diǎn)。雖然B.subtilis的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞很容易在土壤中死亡，但孢子能存活至少2個(gè)月[25]。Mizumoto[23]等對(duì)lpa-14基因進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)缺失菌株R△1在14 d仍有大量的孢子存活，而本研究中S1處理孢子僅有51 CFU/g干土，可能是由于ituD基因的缺失，從而影響了孢子的存活，使菌株不能有效的定殖。

土壤中iturin A的量對(duì)植物病原真菌起重要的作用，土壤中iturin A在幼苗發(fā)芽之前就將R.solani殺死[26]。在本研究中，S44-A處理的土壤中均提取到iturin A，而在S1處理的土壤中未檢測(cè)到iturin A。S44-A處理的土壤中，隨著時(shí)間推移iturin A的量逐漸較少，在第14天仍能檢測(cè)到4.27 μg/g，iturin A量的減少可能是由于土壤的化學(xué)降解、土壤的不可逆吸附或者空氣中污染物的降解。土壤的可降解性和iturin A的短暫持久性可能是生物菌劑優(yōu)于長(zhǎng)期在土壤中持久存在的化學(xué)農(nóng)藥的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)[23]。盡管iturin A提取物對(duì)多種病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用[26-29]，但是否提高iturin A濃度會(huì)增加iturin A在土壤中的效力還有待研究[24]。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)B.subtilisS44菌株ituD基因功能進(jìn)行分析，通過抑菌試驗(yàn)和qRT-PCR分析野生菌株S44及ituD缺失菌株S1中ituD基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)ituD基因幾乎沒有表達(dá)，其抑菌活性喪失。且盆栽實(shí)驗(yàn)顯示S1菌株幾乎沒有抑制效果；進(jìn)一步測(cè)定土壤中菌含量，采用HPLC對(duì)土壤中的iturin A進(jìn)行檢測(cè)，S44-A菌株能在土壤中穩(wěn)定定殖，14 d后在土壤中檢測(cè)到iturin A；與S44-A相比S1隨著時(shí)間推移存活量較少，并且在14 d后土壤中未檢測(cè)到iturin A。本研究結(jié)果表明，ituD基因是S44菌株抑菌物質(zhì)產(chǎn)生、菌株在植物根際定殖與調(diào)控的關(guān)鍵因子。