伍曉麗，李隆云，王 鈺，劉 飛，陳大霞

(1. 重慶市中藥研究院種植研究所，重慶 400065；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；3. 重慶市中藥研究院大健康中心，重慶 400065)

【研究意義】黃連(味連)(CoptischinensisFranch)為毛茛科植物黃連的干燥根莖，是我國內(nèi)銷和出口的大宗藥用植物[1]。黃連味苦,性寒,歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng),用于濕熱痞滿、嘔吐吞酸、高熱神昏、牙痛、消渴、癰腫疔瘡，外治濕疹、耳道流膿等癥[2]。重慶石柱縣是我國黃連重要道地產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量占我國黃連產(chǎn)量的60 %，世界產(chǎn)量的40 %。而根腐病是制約石柱黃連產(chǎn)業(yè)的主要病害，常年發(fā)病率10 %～20 %，嚴(yán)重的地塊發(fā)病率60 %～90 %，甚至絕收，經(jīng)濟(jì)損失約4～5萬元/667m2，給連農(nóng)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。該病目前尚無有效的防治方法。【前人研究進(jìn)展】微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)最重要的組成部分，在土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)、肥力形成、污染物降解以及能量流動方面具有重要的作用[4-6]。Arancon、余妙等研究表明土壤微生物的數(shù)量和活性與植物發(fā)病率之間有很密切的關(guān)系[7-8]。由此推測，黃連土壤中的微生物組成可能對黃連根腐病的發(fā)生有較大影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期研究表明，黃連根腐病是真菌性病害[9]，因此本研究用高通量測序方法測定了石柱4個黃連主產(chǎn)地根腐病植株和健康植株的根際土壤真菌，并對相對應(yīng)的根部的真菌進(jìn)行了分離鑒定，在此基礎(chǔ)上比較根腐病/健康植株的根際土壤和根部的真菌組成。【擬解決的關(guān)鍵問題】為揭示土壤真菌與黃連根腐病發(fā)生的關(guān)系，以及明確黃連根腐病的病原菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣時期：在根腐病發(fā)病盛期(7-8月)后的9月；采樣地點(diǎn)：石柱4個黃連主產(chǎn)地沙子鎮(zhèn)(S)、冷水鎮(zhèn)(L)、黃水鎮(zhèn)(H)、楓木鎮(zhèn)(F)；黃連生長年限：二年生、三年生；黃連健康狀況：健康植株(T1)、根腐病植株(T2)。

分別采集黃連植株和對應(yīng)的根際土壤。按照五點(diǎn)法在每個地塊選取采樣點(diǎn)，一個地塊的5個樣品混勻?yàn)橐粋€樣。根際土壤取樣采用“抖根法”，將土壤表面 5 cm 以上的土壤扒掉，將植株根系從土壤中挖出并抖掉與根系松散結(jié)合的土體，然后采集與根系緊密結(jié)合的土壤(0～4 mm)并用冰盒帶回存于-80 ℃?zhèn)溆?。相?yīng)植株置于無菌袋裝回，用于分離根部真菌。共計(jì)16個土壤樣品和16個根樣品。采樣點(diǎn)詳細(xì)地理信息見表1。

表1 采樣點(diǎn)地理信息

1.2 方法

1.2.1 土壤真菌總DNA提取及ITS序列擴(kuò)增 參考宋旭紅等[10]土壤真菌高通量測序分析。

1.2.2 黃連植株根部可培養(yǎng)真菌分析 ① 可培養(yǎng)真菌分離與純化：黃連根部可培養(yǎng)真菌分離與純化操作參考伍曉麗等[11]。②可培養(yǎng)真菌分子鑒定：采用B518259 Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒按照說明書操作提取分離出的真菌基因組DNA，經(jīng)NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測DNA含量后對ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和操作參考伍曉麗等[11]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送華大基因公司測序。引物序列如下。ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。③種群多樣性和相似性分析：定義同種或同屬菌株作為同一分類單元，計(jì)算根部分離的可培養(yǎng)真菌Shannon-Wiener 指數(shù)(H’)。計(jì)算公式如下，k為宿主體內(nèi)內(nèi)生真菌種類的總數(shù)；Pi是指某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占全部內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的百分率[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連根際土壤真菌分析

2.1.1 病株/健株根際土壤真菌多樣性比較 對采集地16個土壤真菌群落進(jìn)行多樣性統(tǒng)計(jì)，見表2。

表2 根際土壤樣本真菌多樣性指數(shù)

對T1和T2的Observed_species、Shannon指數(shù)等作配對t測驗(yàn)，結(jié)果病株和健株根際土壤真菌多樣性沒有顯著性差別(P>0.05)，見表3。

表3 病株/健株根際土壤真菌多樣性指數(shù)配對t測驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 病株/健株根際土壤真菌組成 根腐病病株和健株根際土壤有3351個共有OTUs,二者的特有OTUs數(shù)量不同。4個地點(diǎn)的病株和健株共有OTUs和特有OTUs也差異較大(圖1)。

圖1 黃連根際土壤真菌組成 OTUs Venn圖Fig.1 The Venn figure of C. chinensis rhizosphere soil fungi OTUs

2.1.3 病株/健株根際土壤真菌在門、屬、種水平的差異 病株和健株根際土壤真菌優(yōu)勢門是子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)。健株根際土壤中不少門的真菌比病株根際土壤真菌高，前者球囊菌門(Glomeromycota)真菌是后者的2.56倍，壺菌門(Chytridiomycota)是2.35倍，蟲菌門(Entomophthoromycota)是3.48倍， Aphelidiomycota門是19倍(圖2)。

圖2 健康和根腐病黃連根際土壤中門水平相對豐度排名前10的真菌分布Fig.2 The top 10 fungi in healthy and root rot C. chinensis rhizosphere soil at phylum level

無論是健株還是病株，根際土壤中豐度最高的屬都是Saitozymasp.、Solicoccozymasp.、Archaeorhizomycessp.、Mortierellasp.、Fusariumsp.Aaosphaeriasp.、Trichocladiumsp.、Phomasp.、Trichodermasp.等。其中病株根際土壤中Phomasp.是健株根際土壤中的3.17倍，病株根際土壤中Aaosphaeriasp.是健株根際土壤中的5.69倍，健株根際土壤中Petriellasp.是病株根際土壤中的3.51倍，其余屬差別不大(圖3)。

圖3 健康和根腐病黃連根際土壤中屬水平相對豐度排名前10的真菌分布Fig.3 The top 10 fungi in healthy and root rot C. chinensis rhizosphere soil at genus level

2種黃連土壤中豐度高的真菌菌種均是S.podzolica、S.terricola、F.oxysporum、M.humilis、T.asperum、M.globulifera等。A.arxii在病株土壤中豐度是健株土壤的5.69倍,P.adonidicola在病株土壤中豐度是健株土壤的3.21倍, 健株根際土壤中C.geophilum是病株根際土壤中的18.36倍(圖4)。

圖4 健康和根腐病黃連根際土壤中種水平相對豐度排名前10的真菌分布Fig.4 The top 10 fungi in healthy and root rot C. chinensis rhizosphere soil at species level

對健株和病株根際土壤中在門水平、屬水平、種水平排名前10的真菌的OTUs數(shù)和豐度進(jìn)行配對t測驗(yàn)，結(jié)果差異均不顯著(P>0.05,表4)。

表4 病株/健株根際土壤真菌門、屬、種水平OTUs數(shù)和豐度配對t測驗(yàn)

2.2 黃連病株/健株根部可培養(yǎng)真菌的比較

2.2.1 病株/健株根部可培養(yǎng)真菌數(shù)量 從4個產(chǎn)地二、三年生的病株和健株共計(jì)16個樣品的根部一共分離出真菌207株。各地的病株根分離出的真菌株數(shù)均比健株根多。尤其是沙子，病株根中分離到的菌株數(shù)是健株根的2.5倍(圖5)。

圖5 4個產(chǎn)地黃連病株/健株根部可培養(yǎng)真菌數(shù)量Fig.5 The cultivable fungi in healthy and rot C. chinensis root from 4 sampling points

2.2.2 病株/健株根部可培養(yǎng)真菌分離頻率統(tǒng)計(jì) 健株根中共分離出真菌75株，屬于38個種，26個屬。病株根中共分離出真菌132株，屬于54個種，29個屬。健株根中優(yōu)勢種是C.orchidicola；病株根中優(yōu)勢種是P.herbarum。健株根中優(yōu)勢屬是Cadophorasp.；病株根中優(yōu)勢屬依次是Phomasp.、Ilyonectriasp.(表5)。

表5 黃連病株/健株根部可培養(yǎng)真菌種、屬水平分離頻率統(tǒng)計(jì)

續(xù)表5(Continued table 5)

2.2.3 不同產(chǎn)地病株/健株根部可培養(yǎng)真菌分別統(tǒng)計(jì) 從冷水鎮(zhèn)天鵝村二、三年生根腐病黃連根部分離得到真菌共計(jì)26 株，屬于16個種，13屬；從該地健康黃連根部分離得到真菌共計(jì) 16 株，屬于13個種，12屬。

從楓木鎮(zhèn)昌坪村二、三年生根腐病黃連根部分離得到真菌共計(jì)32株，屬于 19個種，14屬；從該地健康黃連根部分離得到真菌共計(jì)18株，屬于14個種，11 屬。

從黃水鎮(zhèn)橫店村二、三年生根腐病黃連根部分離得到真菌共計(jì) 34 株，屬于16 個種，9屬；從該地健康黃連根部分離得到真菌共計(jì) 25 株，屬于13 個種，11屬。

從沙子鎮(zhèn)盤龍村二、三年生根腐病黃連根部分離得到真菌共計(jì)40株，屬于 21個種，14屬；從該地健康黃連根部分離得到真菌共計(jì)16株，屬于 6個種，4屬(表6～7)。

2.2.4 不同產(chǎn)地黃連根部可培養(yǎng)真菌Shannon-Wiener 指數(shù) 健株根部真菌在種水平Shannon-Wiener指數(shù)上楓木鎮(zhèn)最高，沙子鎮(zhèn)最低；在屬水平上冷水鎮(zhèn)最高，沙子鎮(zhèn)最低。病株根部真菌在種水平上楓木鎮(zhèn)最高，黃水鎮(zhèn)最低；在屬水平冷水鎮(zhèn)最高，沙子鎮(zhèn)最低?？傮w而言，從種水平上看，4個地方病株根部真菌多樣性均比健株高，屬水平上健株比病株高(表8)。

表8 不同產(chǎn)地黃連根部可培養(yǎng)真菌Shannon-Wiener 指數(shù)

3 討 論

總體上看，病株和健株根際土壤真菌多樣性沒有顯著性差異，且2種土壤中含量高的真菌在門水平、屬水平、種水平的OTUs數(shù)和豐度差異均不顯著。

土壤中的真菌可采用高通量測序法進(jìn)行檢測，而由于結(jié)果準(zhǔn)確性不高，很少采用高通量測序技術(shù)檢測植物體內(nèi)的真菌，因此本研究采用組織分離法對黃連根部真菌進(jìn)行研究。

健株根中優(yōu)勢種是C.orchidicola；優(yōu)勢屬是Cadophorasp.；病株根中優(yōu)勢種是P.herbarum；優(yōu)勢屬是Phomasp.、Ilyonectriasp。前期初步的離體回接研究結(jié)果顯示，Ilyonectriasp.含有疑似病原真菌?？傮w而言，種水平上4個地方病株根部真菌多樣性均比健株高，屬水平上健株比病株高。

C.orchidicola在病株中的分離頻率很低，僅1.52 %。卻是健株根中的優(yōu)勢種，分離頻率高達(dá)20 %。Cadophorasp.是健株中的優(yōu)勢屬，分離頻率21.33 %，在病株中分離頻率僅1.52 %。且在4個產(chǎn)地變化趨勢均一致，是一個規(guī)律性明顯的現(xiàn)象。C.orchidicola(異名Leptodontidiumorchidicola)[14]，屬于深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophytes，DSE)的一種。DSE是植物內(nèi)生真菌的主要類群，它可與健康植物形成共生體而不引起植物病變，具有與菌根類似功能[15-16]，且抗逆境、防病蟲等功能顯著,是目前研究的熱點(diǎn)菌群[17-20]。因此，DSE被廣泛應(yīng)用于番茄、香蕉、黃瓜等植物的抗病研究[21-23]。

4 結(jié) 論

大體而言土壤中真菌數(shù)量及組成對根腐病的發(fā)生沒有明顯的影響。當(dāng)然也不排除健康/根腐病黃連土壤中某些含量低的真菌有明顯差別，尤其是致病菌。擬在通過分離、回接、鑒定確定根腐病病原菌后，重點(diǎn)對土壤中這部分菌進(jìn)行比較。

病原菌可能是某一個屬或幾個屬內(nèi)的多種真菌。根部真菌屬水平多樣性的降低可能與根腐病發(fā)病相關(guān)。

DSE菌C.orchidicola在健康黃連根部含量遠(yuǎn)高于根腐病黃連根部，這是否是個規(guī)律性現(xiàn)象，黃連根條中還含有哪些DSE菌，它們與黃連根腐病的關(guān)系如何，值得進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。