陳姝欣，朱浩東，楊夢(mèng)思，陶連德，鐘啟文，楊世鵬

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)，青海 西寧 810016)

【研究意義】人參果(Solanummuricatum)又被稱為香瓜茄，是一種原產(chǎn)于南美洲的多年生茄科草本植物。成熟后的人參果果皮底色為玉白色或者金黃色，大部分的人參果皮上有紫色花紋，果肉金黃[1]，是一種漿果類作物，不僅可以作為一種觀賞植物，且味道清甜，無(wú)酸澀感，微量元素極其豐富，特別是硒[2]，而且富含維生素，對(duì)于其他水果而言具有相對(duì)較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)未見(jiàn)人參果分子領(lǐng)域研究的報(bào)道，相關(guān)分子標(biāo)記的研究還尚在標(biāo)記開(kāi)發(fā)的階段。SSR是一種微衛(wèi)星序列，主要由一到六個(gè)核苷酸的重復(fù)構(gòu)成[3]。其兩端的序列是兩段非常保守的序列，若將這2個(gè)側(cè)翼序列作為這段微衛(wèi)星序列的引物，就可擴(kuò)增出中間的重復(fù)序列，而這段微衛(wèi)星序列重復(fù)單元之間的數(shù)目通常是具有較大差異的，存在著豐富的多態(tài)性[4]。SNP標(biāo)記和SSR標(biāo)記的區(qū)別在于SNP是指單個(gè)堿基的變異，例如堿基的缺失、轉(zhuǎn)換等。最近幾年高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展十分昌盛，這也使得SSR及SNP技術(shù)發(fā)展迅猛，這2種分子標(biāo)記技術(shù)由于其方便快捷的特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于親緣關(guān)系、指紋圖譜的構(gòu)建等多個(gè)領(lǐng)域?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我國(guó)目前僅以大果、小果、長(zhǎng)果、圓果等對(duì)人參果進(jìn)行簡(jiǎn)單區(qū)分,命名不夠科學(xué),且常與用特定模具進(jìn)行定形后的西葫蘆人參果混淆,阻礙了人參果的推廣以及種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)。因此,分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)對(duì)于完善人參果遺傳圖譜的構(gòu)建和品種分類有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文主要是對(duì)人參果的轉(zhuǎn)錄組通過(guò)MISA軟件[5]檢索SSR位點(diǎn)并用GATK[6]進(jìn)行SNP的識(shí)別, 通過(guò)分析其SSR位點(diǎn)和SNP位點(diǎn)的組成和特征, 從而完善人參果的分子標(biāo)記, 為今后人參果利用分子標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與過(guò)程

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究實(shí)驗(yàn)材料取自青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝所實(shí)驗(yàn)溫室，選取室內(nèi)苗齡兩年的扦插人參果苗，將未開(kāi)花、正在開(kāi)花、已經(jīng)結(jié)果但果實(shí)未成熟、已有成熟果實(shí)設(shè)置為4個(gè)處理，采集處于不同時(shí)期的人參果苗的葉片各3份液氮冷凍，將材料放置于-80 ℃環(huán)境下保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取 用Trizol法[7]提取人參果總RNA，經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)后利用天根TGem Spectrophotomoter檢測(cè)提取的總RNA的含量是否符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)組裝 提取的人參果葉片總RNA經(jīng)脫氧核糖核酸酶I (DNase I )處理后,用含oligod dt的磁珠使mRNA富集、純化。利用mRNA片段化反應(yīng)體系將mRNA打斷成短片段，以得到的短mRNA為模板合成1st Strand cDNA (cDNA第一鏈),再以第一鏈為模板加入合成序列所需緩沖液、無(wú)核苷酸酶水、第二鏈cDNA合成酶混合物，從而合成第二鏈，將得到的cDNA純化回收修復(fù)其粘性末端，在其3'端加上多聚(A)尾巴，且連接測(cè)序接頭。使用電泳技術(shù)對(duì)序列長(zhǎng)度進(jìn)行篩選，通過(guò)PCR擴(kuò)增序列后利用Illumina Hiseq 2500精確測(cè)序平臺(tái)對(duì)所制備的文庫(kù)測(cè)序。過(guò)濾人參果葉片樣品的測(cè)序原始數(shù)據(jù)，以除去包含接頭或低質(zhì)量的序列，得到干凈序列。對(duì)所有干凈序列通過(guò)Trinity(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)進(jìn)行組裝拼接,將拼接得到的所有序列中最長(zhǎng)的序列作為基因組數(shù)據(jù)庫(kù)用于后續(xù)分析。

1.2.3 SSR和SNP的獲取 對(duì)提取所得人參果總RNA進(jìn)行測(cè)序得到人參果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)利用MISA軟件搜索人參果轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)。同時(shí)運(yùn)用STAR[8]比對(duì)軟件對(duì)所得Reads和Unigene序列比對(duì)，并利用GATK的SNP識(shí)別流程[9]，識(shí)別SNP位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)人參果的RNA進(jìn)行提取，利用電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行初步檢測(cè)，能明顯看到28S、18S和5.8S的條帶。繼而用TGem Spectrophotomoter檢測(cè)RNA純度，得到的RIN值均符合測(cè)序所需純度要求，且無(wú)肉眼可見(jiàn)的蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)等。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果及統(tǒng)計(jì)

通過(guò)拼接與組裝，共得到68 891條Unigene，序列總長(zhǎng)度為53 356 976 bp，平均長(zhǎng)度為775 bp。在200～2000 bp分布著絕大部分的序列，這個(gè)長(zhǎng)度范圍的序列占總序列的90.84 %。隨著Unigene長(zhǎng)度的逐漸增加，其占有數(shù)量呈梯度下降之勢(shì)，其中長(zhǎng)度范圍在200～300 bp的序列數(shù)量居多，占總數(shù)的34.85 %，其余按占有率依次向排列是300～500、500～1000、1000～2000以及2000 bp以上序列，數(shù)量分別為24 010、16 547、12 488、9534和6312條，占所有Unigene的比例分別為34.85 %、24.02 %、18.13 %、13.84 %和9.16 %(表1)。

表1 人參果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 SSR特征分析

利用MISA軟件在68 891條Unigene中搜索到5282個(gè)SSR位點(diǎn)，其中完整型SSR共有4947條，而復(fù)合型SSR共有335條。完整型SSR的數(shù)量約是復(fù)合型的15倍，SSR的出現(xiàn)頻率為7.18 %，分布密度為1/6148 bp，即平均約6148 bp就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)位點(diǎn)。搜索獲得的SSR序列總長(zhǎng)度為87.963 kb (0.27 %)，SSR序列所占的比例不到整個(gè)人參果轉(zhuǎn)錄組序列的1 %。通過(guò)對(duì)搜索到的SSR進(jìn)行長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)，有60.53 %的SSR長(zhǎng)度在10～14 bp，SSR的數(shù)量隨著長(zhǎng)度的增加急劇下降，分布在15～19、20～29、30～49、50～100 bp的SSR分別占比26.96 %、6.47 %、2.37 %、2.35 %，只有1.33 %的SSR的長(zhǎng)度超過(guò)100 bp(圖1)。

圖1 搜索得到的SSR長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.1 SSR length statistical results

對(duì)SSR核苷酸重復(fù)次數(shù)(圖2)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中單核苷酸重復(fù)的SSR共2908條 (58.78 %) ，雙核苷酸重復(fù)的SSR共805條 (16.27 %) ，三核苷酸重復(fù)的SSR共1184條 (23.93 %) ，四核苷酸重復(fù)的有33條(0.67 %)、五核苷酸重復(fù)的有2條(0.04 %)、六核苷酸重復(fù)的有15條 (0.30 %)。由此可見(jiàn)人參果的SSR基元類型中，單核苷酸占一半以上，二核、三核苷酸重復(fù)的SSR占比總和也不及單核苷酸的占比。僅有50個(gè)SSR重復(fù)基元的數(shù)量大于3。

圖2 搜索得到的SSR重復(fù)種類統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.2 Statistical results of SSR repeat types

在單核苷酸重復(fù)類型中，A/T類型有2887個(gè)(99.28 %)，C/G類型僅有21個(gè)(0.72 %)；在二核苷酸重復(fù)類型中，有398個(gè)屬于AG/CT類型，這個(gè)數(shù)量占此重復(fù)類型總量的49.44 %，占總二核苷酸重復(fù)類型數(shù)量的一半。CG/CG類型的僅有2個(gè)，占比0.25 %，AT/AT和AC/GT分別占總量的34.14 %和16.15 %；三核苷酸重復(fù)類型共有18種，最多的是AAG/TTC數(shù)量為235個(gè)，占到總數(shù)的19.85 %，其次是AAC/TTG(113個(gè))，最少的是CGC/GCG(16個(gè))；四核苷酸重復(fù)有18種，最多的是AAGA/TCTT(6個(gè))，其他種類個(gè)數(shù)均較少，1和2個(gè)的占比之和達(dá)到了58.82 %；五核苷酸重復(fù)有2種，每種分別有1個(gè)；六核苷酸重復(fù)有15種，每種的數(shù)量和五核苷酸重復(fù)一樣，也是1個(gè)。

人參果轉(zhuǎn)錄組中SSR單元重復(fù)次數(shù)主要分布區(qū)間為1～25次，在此區(qū)間內(nèi)又以6～10次的重復(fù)為主，此類重復(fù)基元共有2604個(gè)(52.64 %)SSR位點(diǎn)，其中單核苷酸類型的SSR有1438個(gè)，占重復(fù)次數(shù)為6～10的SSR數(shù)量的55.22 %，其他類型的SSR數(shù)量趨勢(shì)隨著其核苷酸基元數(shù)量的增加而遞減；其次為11～15次的重復(fù)，共有1271個(gè)SSR位點(diǎn)，占總重復(fù)單元的25.69 %，單核苷酸重復(fù)類型的SSR數(shù)量為1243個(gè)，占11～15次重復(fù)的97.78 %；1～5次的重復(fù)有845個(gè)SSR位點(diǎn)，占SSR總數(shù)的17.08 %；16～20次的重復(fù)共有176個(gè)SSR位點(diǎn)，占SSR總數(shù)的3.56 %；20次以上的重復(fù)次數(shù)最少，僅有51個(gè)SSR位點(diǎn)，且這51個(gè)SSR均是單核苷酸的重復(fù)。由表2可見(jiàn)，當(dāng)重復(fù)次數(shù)大于5時(shí)，SSR的基元均以單核苷酸為主，當(dāng)重復(fù)次數(shù)小于5時(shí)，三核苷酸是主要的重復(fù)基元。

圖3 二核苷酸重復(fù)類型數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics of dinucleotide repeat types

表2 SSR重復(fù)基元類型統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 SNP結(jié)果分析

對(duì)得到的68 891條序列進(jìn)行了SNP位點(diǎn)搜索，成功搜索到315 132個(gè)SNP位點(diǎn)，SNP的分布密度為1/103 bp，即平均約103 bp就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)。在搜索得到的SNP位點(diǎn)中，屬于轉(zhuǎn)換類型的有192 575個(gè)，而屬于顛換類型的有120 621個(gè)。A/G在所有變異類型中所占的比例最高，為總量的36.01 %，C/T占總量19.24 %，位居其次。觀察可得，比例較高的2種變異類型A/G和C/T均屬于轉(zhuǎn)換類型，而剩下的4種顛換類型所占的比例均低于15 %，其中A/T占總數(shù)的13.08 %，G/T占總數(shù)的12.14 %，A/C占總數(shù)的12.14 %，C/G最少，僅占總數(shù)的7.39 %。在所占比例中，轉(zhuǎn)換類型所占的比例61.10 %顯著大于顛換類型的比例38.27 %，故人參果的SNP變異類型以轉(zhuǎn)換類型為主。

3 討論與總結(jié)

在人參果的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中有68 891條Unigene，其中有15 846條Unigene含有SSR位點(diǎn)，共有5282個(gè)SSR位點(diǎn)在搜索后被發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)頻率為7.18 %，低于油茶(33.58 %)[9]、南酸棗(25.52 %)[10]、香椿(19.91 %)[11]、云南金花茶(19.63 %)[12]、黑枸杞(18.98 %)[13]、香蕉(18.53 %)[14]、油梨(17.05 %)[15]、馬藍(lán)(16.49 %)[16]、太子參(8.87 %)[17]，比較接近于山地虎耳草的SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率(7.25 %)[18]，高于馬尾松(1.06 %)[19]、洋蔥(5.10 %)[20]等植物。說(shuō)明人參果的SSR出現(xiàn)頻率并不高。

圖4 SNP變異類型統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.4 Statistical results of variation type of SSR

在人參果SSR基元重復(fù)類型中，單核苷酸重復(fù)(58.78 %)是人參果重復(fù)類型中占比最多的一種，比例為23.93 %的三核苷酸重復(fù)僅次于單核苷酸重復(fù)。這與瓠瓜[21]、辣椒[22]和紅松[23]類似，而與黨參[24]、野三七[25]等以二核苷酸為主要重復(fù)類型的植物不同。AG/CT在SSR二核苷酸重復(fù)類型中有398個(gè)，是數(shù)量最多的類型,其次為AT/AT(275個(gè))，AC/GT相對(duì)而言較少，有130個(gè),而CG/CG重復(fù)出現(xiàn)頻率極低，僅有2個(gè)，這與蠟梅[26]、野三七[25]和李府貢棗[27]等植物的二核苷酸重復(fù)類型結(jié)果一致，AAG/CTT是人參果轉(zhuǎn)錄組中數(shù)量最多的三核苷酸重復(fù)，這符合了雙子葉植物的普遍規(guī)律[28]。1～25次之間是SSR基元重復(fù)次數(shù)的分布范圍，以6～10次重復(fù)為主，其次為11～15次的重復(fù)，1～5次的重復(fù)有845個(gè)SSR位點(diǎn)，即有17.08 %的SSR單元的重復(fù)次數(shù)在1～5；16～20次的重復(fù)共有176個(gè)SSR位點(diǎn)，占SSR總數(shù)的3.56 %；20次以上的重復(fù)次數(shù)最少，僅有51個(gè)SSR位點(diǎn)，且以單核苷酸為主。這與寶巾花[29]、冬蟲夏草[3]等植物基本一致。

在測(cè)序所得的轉(zhuǎn)錄組中共找到SNP位點(diǎn)315 132個(gè)，其分布密度為1/103 bp。SNP位點(diǎn)中轉(zhuǎn)換類型有192 575(61.49 %)個(gè)，顛換類型有120 621個(gè)(38.51 %)。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)換類型的比例(61.49 %)幾乎達(dá)到了顛換類型的比例(38.51 %)的1.6倍，故人參果SNP變異類型以轉(zhuǎn)換類型為主，這與棒腺虎耳草[30]、盾葉薯蕷[31]、青楊[32]等結(jié)果一致。A/G占的比例在所有變異類型中最高，為總量的36.01 %，其次占總量19.24 %是C/T，而剩下的4種顛換類型所占的比例均低于15 %，其中A/T占13.08 %，G/T占總數(shù)的12.14 %，A/C占總數(shù)的12.14 %，C/G最少，僅占總數(shù)的7.39 %。

人參果轉(zhuǎn)錄組中得到的SNP分子標(biāo)記的發(fā)生頻率比SSR高很多，表明單核苷酸的變異在人參果的基因組中更容易發(fā)生。本次對(duì)人參果轉(zhuǎn)錄組的分析說(shuō)明SSR和SNP分子標(biāo)記對(duì)于研究人參果品種有一定意義，但人參果目前SSR標(biāo)記出現(xiàn)頻率較低，數(shù)量不夠豐富，但此類SSR分子標(biāo)記將對(duì)今后的人參果研究奠定強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。