周喆，陳志丹，吳全金，徐一嵐，孫威江1,*

白雞冠茶樹基因全長(zhǎng)cDNA克隆與表達(dá)分析

周喆1,2,4，陳志丹2,3,4，吳全金5，徐一嵐3，孫威江1,2,3,4*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2. 安溪縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 泉州 362400；3. 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；4. 福建省茶葉工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；5. 福建廣播電視大學(xué)財(cái)經(jīng)與管理系，福建 福州 350002

脫鎂葉綠素酶（Pheophytinase，PPH）是葉綠素降解過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它能使脫鎂葉綠素a轉(zhuǎn)化為脫鎂葉綠酸a，脫鎂葉綠酸a是葉綠素降解途徑中最后一個(gè)保持植物綠色的產(chǎn)物，被認(rèn)為是葉片衰老和黃化的關(guān)鍵步驟。以新梢白化茶樹白雞冠葉片為材料，克隆獲得基因cDNA的全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)：MK359094），并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，全長(zhǎng)為1?298?bp，包含的ORF序列為1?241?bp，編碼413個(gè)氨基酸。序列分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)為穩(wěn)定疏水蛋白，其預(yù)測(cè)分子量為45?741.50?Da，理論等電點(diǎn)為6.12。預(yù)測(cè)該基因主要定位于葉綠體中。qRT-PCR結(jié)果顯示，遮蔭抑制白雞冠葉片的表達(dá)，葉綠素升高，葉色變綠；光照促進(jìn)白雞冠葉片的表達(dá)，葉綠素降解，導(dǎo)致葉片白化。

茶樹白化；基因；克?。簧镄畔W(xué)分析

近年來，我國(guó)茶樹品種和茶葉品類呈“五顏六色”發(fā)展趨勢(shì)[1]。白雞冠是武夷山“四大名叢”之一，自發(fā)現(xiàn)并被利用至今已有三百余年的歷史[2]。王開榮等[3]研究提出，光照敏感型白化茶的白化—返綠共性取決于光照強(qiáng)度，隨光照強(qiáng)度增強(qiáng)白化明顯，而與溫度、土質(zhì)、肥培條件基本無關(guān)。Wu等[4]研究表明，白雞冠茶樹屬于光照敏感型茶樹。目前，茶樹白化葉片產(chǎn)生的原因有很多，主要聚焦于葉綠素合成途徑和類胡蘿卜素途徑。前人研究認(rèn)為，由于白化茶樹葉綠素合成少于常規(guī)綠葉品種，導(dǎo)致新梢白化[5-7]。類胡蘿卜素生物合成被抑制也會(huì)導(dǎo)致茶樹在強(qiáng)光或正常光照下產(chǎn)生光氧化損傷，從而對(duì)葉綠體發(fā)育造成影響[5,8]，形成白化表型。但也有研究報(bào)道指出，其可能是葉綠素的降解速率大于合成速率，導(dǎo)致葉色白化[9]。

脫鎂葉綠素酶（Pheophytinase，PPH）是葉綠素降解代謝中的關(guān)鍵酶。自2009年發(fā)現(xiàn)了基因后，葉綠素降解途徑的研究又進(jìn)一步更新[10-11]。葉綠素降解主要有兩條途徑：一是葉綠素a被葉綠素酶（Chlorophyllase，CLH）脫去植醇（Phytol），形成脫植基葉綠素a（Chlorophyllide a），之后在脫鎂酶（SGR）的作用下脫去鎂離子，形成脫鎂葉綠酸a（Pheophorbide a），又在脫鎂葉綠素加氧酶（Pheophorbide a oxygenase，PAO）作用下形成紅色葉綠素代謝副產(chǎn)物（Red chlorophyll catabolite，RCC），然后被RCC還原酶（Red chlorophyll catabolite reductase，RCCR）還原成初級(jí)熒光葉綠素分解代謝產(chǎn)物（Primary fluorescent chlorophyll catabolite，PFCC）；二是葉綠素a先被脫鎂酶脫去鎂離子，形成脫鎂葉綠素a（Pheophytin a）后被基因催化脫去植醇，形成脫鎂葉綠酸a，此后降解與第一條途徑一樣，最終降解成初級(jí)熒光葉綠素分解代謝產(chǎn)物（PFCC）[12-14]?；蛭挥谌~綠素降解途徑2，能夠?qū)Ｒ幻撊ブ泊?，形成脫鎂葉綠酸a。許多研究者克隆了不同植物中的基因，發(fā)現(xiàn)可能會(huì)促進(jìn)植物衰老[15-17]。葉綠素的合成與降解是由多組酶參與的過程，其中任何一個(gè)編碼酶基因的突變都有可能使相關(guān)酶的活力發(fā)生改變，影響相關(guān)物質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致葉綠素降解過程受阻，使葉色表現(xiàn)出不同程度的變化[18]。在常規(guī)綠葉植物中，它的缺失會(huì)使植物呈現(xiàn)滯綠表現(xiàn)型，導(dǎo)致葉綠素降解過程減緩[15]?；蛟谒綶19]、甘藍(lán)[20]、黃瓜[15,21]、小麥[22]、鳳梨[23]、芥藍(lán)[24]、花椰菜[25-26]等植物中相繼被克隆，但是前人對(duì)植物基因的研究多集中于其造成的植物衰老滯綠方面[15]，關(guān)于基因在白化茶樹中的作用機(jī)制，目前鮮有研究。

白雞冠與常規(guī)綠色茶樹品種相比，其關(guān)鍵化學(xué)成分和轉(zhuǎn)錄模式都有很大不同。研究其葉綠素代謝過程中的分子機(jī)制，有助于了解白化茶樹體內(nèi)的代謝變化及遺傳變異，對(duì)研究茶樹光合作用機(jī)制、葉色調(diào)控機(jī)理、葉片發(fā)育調(diào)控等有重要理論價(jià)值[27]，同時(shí)也在茶樹生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性、良種繁育等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[28-29]。因此本研究主要以白雞冠茶樹為研究對(duì)象，克隆了基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)信息分析和表達(dá)分析，初步研究不同遮蔭處理下基因的表達(dá)差異導(dǎo)致葉綠素降解差異對(duì)白雞冠茶樹葉片白化的影響，為深入研究白雞冠茶樹的白化機(jī)制提供分子方面的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料為白雞冠茶樹葉片，取自武夷星茶業(yè)有限公司種質(zhì)資源圃（北緯27°55′15″，東經(jīng)118°02′50″）。2018年9月中旬，用鋁箔進(jìn)行第二葉位葉片的遮蔭處理，遮蔭處理方法如表1所示。試驗(yàn)記錄頻率為24?h一次，達(dá)到對(duì)應(yīng)遮蔭天數(shù)時(shí)取下鋁箔，觀察白雞冠茶樹葉色的恢復(fù)情況。取樣時(shí)，遮蔭前、遮蔭復(fù)綠及復(fù)綠重新光照葉片作為一組。取生長(zhǎng)發(fā)育狀況相近，形狀大小一致的第二葉位葉片，迅速用液氮冷凍處理，置–80℃冰箱保存，用于基因克隆和qRT-PCR檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片葉綠素含量的檢測(cè)

根據(jù)遮蔭處理組，使用SPAD502葉綠素含量測(cè)定儀（Konica Minolta）對(duì)白雞冠第二葉位葉片進(jìn)行檢測(cè)，主脈兩側(cè)各隨機(jī)選取3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，取平均值。采用Excel 2010和SPSS 22.0進(jìn)行誤差檢驗(yàn)和單因素方差分析（ANOVA）。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成

采用天根的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取白雞冠第二葉的總RNA；用超微量分光光度計(jì)（賽默飛，Nano Drop 2000c）測(cè)定提取的總RNA濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得的總RNA的完整性，于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Promega goscriptTMreverse transcription system（A5000，PROMEGA，USA），按說明書步驟進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，用于后續(xù)的RT-PCR和qRT-PCR試驗(yàn)。

1.2.3基因的全長(zhǎng)cDNA克隆

從NCBI搜索擬南芥的PPH蛋白序列并下載，將其在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)得到候選基因的蛋白序列，根據(jù)得到的蛋白序列編號(hào)檢索茶樹的cDNA序列并下載，最后篩選得到茶樹基因。利用DNAMAN設(shè)計(jì)引物（表2）。在其編碼區(qū)的兩端設(shè)計(jì)引物-F和-R，以白雞冠茶樹第二葉cDNA為模板，使用高保真酶TaKaRa Prime STAR GXL DNA Polymerase：R050A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：5×Prime STAR GXL Buffer 10?μL，dNTP Mixture 4?μL，上下游引物、cDNA模板、Prime STAR GXL DNA Polymerase各1?μL，用ddH2O補(bǔ)至50?μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3?min；98℃變性10?s，56℃退火15?s，68℃反應(yīng)64?s，共34次循環(huán)；72℃延伸5?min。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物條帶，驗(yàn)證后切膠，使用Omega膠回收試劑盒（Gel extraction kit）進(jìn)行膠回收。膠回收產(chǎn)物連接到pESI-Blunt simple vetor（30?g·μL-1）載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)16~18?h后挑取克隆搖菌，菌液經(jīng)PCR驗(yàn)證后挑選5個(gè)陽性克隆送至福州鉑尚測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.4基因的生物學(xué)信息分析

通過NCBI的Blast功能進(jìn)行氨基酸序列同源性比較；通過ProtParam在線網(wǎng)站（http://web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)編碼蛋白的理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)；通過ProtScale（https://web.expasy.org/ protscale）對(duì)蛋白質(zhì)親疏水性分析；通過TMHMM和TMpred（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM）進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/ SignalP）進(jìn)行編碼氨基酸的信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用SMART軟件對(duì)編碼蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，運(yùn)用Scratch Protein Prodictor和Phyre2對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過NCBI-CDD分析保守結(jié)構(gòu)域。通過TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）預(yù)測(cè)茶樹基因的亞細(xì)胞定位；運(yùn)用MEGA 7.0軟件中的近鄰相接法（Neighbor-Joining，NJ）（500 Bootstrap Method）構(gòu)建基因同源進(jìn)化樹。

1.2.5基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

表2 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 CsPPH基因的cDNA全長(zhǎng)克隆

經(jīng)克隆得到基因的cDNA全長(zhǎng)序列為1?298?bp。經(jīng)開放閱讀框（ORF）軟件分析，基因含有1?241?bp的完整ORF，編碼413個(gè)氨基酸（圖1）。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果與預(yù)期相符（圖2）。

2.2 CsPPH基因的生物學(xué)信息分析

利用在線軟件ProtParam對(duì)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)與分析，預(yù)測(cè)該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為45?741.50?Da，編碼413個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為6.12，包含6?481個(gè)原子，分子式為C2080H3247N555O591S8。其中，該蛋白氨基酸組成成分中亮氨酸（Leu）含量最高，占比14.0%；除了吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）占比為0以外，半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）占比最低，為1.0%。其半衰期在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)為30?h，在酵母細(xì)胞內(nèi)大于20?h，在大腸桿菌內(nèi)大于10?h。CsPPH的消光系數(shù)為60?640，不穩(wěn)定系數(shù)為41.72，為穩(wěn)定蛋白，其脂肪系數(shù)為108.57。通過Prot Scale軟件預(yù)測(cè)分析，CsPPH氨基酸殘基在當(dāng)前整個(gè)區(qū)域中所表現(xiàn)的疏水性要大于親水性，而且大部分都處在正值的較高位置，該蛋白總平均親水性為0.036，故CsPPH蛋白是偏向疏水性的，為疏水性蛋白（圖3）。

TMHMM server 2.0預(yù)測(cè)顯示該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖4）。TargetP亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明該基因定位于葉綠體。SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)該蛋白序列無信號(hào)肽，屬于非分泌性蛋白。NetPhos 3.1 Server對(duì)蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析預(yù)測(cè)（圖5），結(jié)果表明，多肽鏈上共有41個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為27個(gè)絲氨酸（Ser）位點(diǎn)，11個(gè)蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)。磷酸化位點(diǎn)占全序列的9.9%，主要能夠被cdc2蛋白（cdc2）、蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）和酪蛋白激酶I（CKI）等蛋白激酶磷酸化。FoldIndex軟件可折疊性結(jié)果預(yù)測(cè)有序氨基酸殘基數(shù)量占序列總比例的76.7%，判斷其為有序蛋白。采用SCRATCH Protein Prodictor預(yù)測(cè)CsPPH二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：α-螺旋占76.88%，β-折疊占0.08%，無規(guī)則卷曲占23.04%。使用Phyre2對(duì)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖6），該模型基于可溶性環(huán)氧化物水解酶的晶體結(jié)構(gòu)（c3i28A）進(jìn)行建模，二者相似度高達(dá)66%，其預(yù)測(cè)結(jié)果具有較高的可信度。通過NCBI-CDS在線分析基因的保守結(jié)構(gòu)域（圖7），發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列中含有PLN02679結(jié)構(gòu)域，屬于PLN02679超級(jí)家族。

2.3 CsPPH基因進(jìn)化樹構(gòu)建

將該蛋白的氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對(duì)，結(jié)果顯示，其與多個(gè)物種的PPH蛋白序列均有較高的相似性，相似率在70%以上。利用MEGA 7.0對(duì)選取的20條相似度較高的序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示（圖8），茶樹聚在A類，與蓮（）的關(guān)系最近，與蓮、博落回（）、葡萄（）、芝麻（）的PPH蛋白相似性分別達(dá)到88%、80%、79%和77%。利用Jalview軟件對(duì)CsPPH蛋白與其他植物PPH蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示（圖9），該蛋白在各種植物中具有高度保守性。

注：黃色陰影部分為起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，灰色陰影部分表示PLNO2679保守結(jié)構(gòu)域，黑色下劃線為編碼區(qū)

注：M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量，1：CsPPH基因PCR產(chǎn)物

圖3 CsPPH氨基酸序列親/疏水性分析

圖4 CsPPH蛋白的跨膜螺旋區(qū)

圖5 CsPPH磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.4 不同遮蔭處理下白雞冠茶樹葉綠素含量的變化

由表3和圖10可得知，遮蔭處理后，白雞冠茶樹葉片的葉綠素含量均高于不遮蔭白化葉片。隨著遮蔭天數(shù)的增加，白雞冠葉片的葉綠素含量極顯著上升，第6天含量最高，達(dá)到26.98。不遮蔭處理的葉片變化不顯著，恢復(fù)光照的葉片葉綠素含量顯著下降，第6天低至14.30。試驗(yàn)表明，遮蔭顯著影響白雞冠新梢白化葉片的葉綠素含量。

圖6 CsPPH蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖7 CsPPH蛋白功能性位點(diǎn)分析

圖8 CsPPH氨基酸序列進(jìn)化樹分析

注：方框表示超家族的保守結(jié)構(gòu)域PLN02679；A：美花煙草（XP 009792199.1）；B：煙草（XP 019264379.1）；C：芝麻（XP 011096167.1）；D：茶樹(MK359094)；E：蓮（XP 010252240.1）；F：博落回（OVA05823.1）；G：川桑（XP 010112231.1）；H：土瓶草（GAV71596.1）；I：大桉（XP 010063750.1）

2.5 茶樹CsPPH基因在不同遮蔭處理下的表達(dá)模式分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析白雞冠茶樹基因在不同遮蔭處理下的相對(duì)表達(dá)量差異。由圖11所示，基因在進(jìn)行遮蔭處理后的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，在遮蔭第2天達(dá)到最低水平。在不遮蔭處理中，相對(duì)表達(dá)量在第1天和第2天上調(diào)，且在第1天達(dá)到最高水平，在第3天至第6天處于下調(diào)。在恢復(fù)光照處理的白雞冠中，相對(duì)表達(dá)量始終上調(diào)，第1天表達(dá)量最高。通過SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)性和單因素方差分析得到，在不同處理后白雞冠葉片中基因的相對(duì)表達(dá)量與葉綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（=–0.647；=0.007<0.01）。

表3 不同處理下的白雞冠SPAD值

注：不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著，小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

Note: Different majuscule indicate significant difference at 0.01 level, different minuscule indicate significant difference at 0.05 level

圖10 不同處理下白雞冠茶樹二葉SPAD值

注：與不遮蔭和恢復(fù)光照葉片相比，*：差異顯著（P<0.05）

3 討論

植物葉色白化突變產(chǎn)生機(jī)制非常復(fù)雜，涉及到很多調(diào)控途徑和代謝過程，以及內(nèi)外部環(huán)境的共同作用等[26]。光敏型白化茶樹白雞冠作為特殊的茶樹種質(zhì)資源，其轉(zhuǎn)錄模式與常規(guī)綠葉品種有很大不同，白化葉色研究有助于葉綠素代謝、葉綠體發(fā)育及光合系統(tǒng)的研究，同時(shí)也是分子育種的典型材料[25]。白雞冠茶樹對(duì)光強(qiáng)較為敏感，葉綠體發(fā)育不全，葉綠素含量較其他綠葉品種少。

本研究從茶樹中成功克隆到1個(gè)基因，該基因開放閱讀框?yàn)??241?bp，編碼413個(gè)氨基酸，并且含有PPH酶特征序列和α/β水解酶折疊。該蛋白為疏水性蛋白質(zhì)，無跨膜螺旋區(qū)，預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位于葉綠體。在對(duì)其他植物基因的研究中發(fā)現(xiàn)，所有的PPH蛋白質(zhì)都存在α/β水解酶折疊，其主要氨基酸序列顯示的很多區(qū)域在成員之間有高度的保守性，且PPH酶催化反應(yīng)時(shí)都位于葉綠體內(nèi)[21]。

葉綠素的積累在植物體內(nèi)以動(dòng)態(tài)的形式存在[30-31]，是一個(gè)合成與分解的綜合過程。自然強(qiáng)光條件下，白雞冠茶樹隨著光照時(shí)間的增加，葉片SPAD值基本沒有變化，而遮蔭處理的葉片SPAD值線性上升，表現(xiàn)為正常光照的葉色變白，而遮蔭處理的葉片明顯轉(zhuǎn)綠。表明正常光照條件下白雞冠茶樹白化葉片葉綠素含量維持在一個(gè)較低的水平，而遮蔭處理使得葉片的葉綠素含量上升，葉片呈現(xiàn)綠色。這與Fan等[32]的研究相符，他們通過代謝組和蛋白質(zhì)組研究，闡釋了光強(qiáng)對(duì)黃金芽光合色素代謝及光合系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)黃化葉色的產(chǎn)生是由于光照條件下，黃金芽的葉綠素合成降低，而降解增多，導(dǎo)致葉片黃化。白雞冠茶樹白化葉片遮蔭后，體內(nèi)防御酶活性上升，清除由過剩光能產(chǎn)生的活性氧的能力增強(qiáng)，使之從光氧化損傷狀態(tài)恢復(fù)，重組和修復(fù)葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)，使葉綠素能夠正常合成。強(qiáng)光脅迫下，白化葉片防御酶活性低，不能清除由過剩光能產(chǎn)生的活性氧，造成膜損傷，導(dǎo)致類囊體膜結(jié)構(gòu)降解，附著于其上的葉綠素降解，產(chǎn)生白化表型。這與低溫敏感型白化茶樹“安吉白茶”相似[33]。

基因是葉綠素降解機(jī)制的一個(gè)重要組成部分。在進(jìn)行不同遮蔭處理后，白雞冠第二葉基因的表達(dá)顯著下降，結(jié)合SPAD檢測(cè)結(jié)果，表明是脫鎂葉綠素a向脫鎂葉綠酸a的降解過程受阻，使得葉片中脫鎂葉綠素a累積，葉綠素降解過程受阻，導(dǎo)致葉綠素累積，葉片復(fù)綠。這與李旭敏[34]的研究相符，黃金芽葉綠素合成途徑相關(guān)酶基因的抑制性表達(dá)，以及降解途徑相關(guān)酶基因的高表達(dá)是引起其總?cè)~綠素含量低的主要原因。植物葉片衰老也與葉綠素降解有關(guān)。黃瓜[21]、大豆[35]等葉片衰老時(shí)，其葉綠素降解，含量減少，基因表達(dá)量顯著增加，葉色轉(zhuǎn)黃。在本研究中，遮蔭葉片在恢復(fù)光照后葉綠素的含量開始下降，相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，說明光照對(duì)白雞冠的表達(dá)有顯著的調(diào)控作用。

本文結(jié)合葉綠素含量、基因克隆和相對(duì)表達(dá)量的研究結(jié)果，初步闡釋了葉綠素降解對(duì)白雞冠的白化機(jī)制起到關(guān)鍵作用。今后可以從分子角度深入把控白化機(jī)制，分離并研究具有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因，對(duì)白化突變體的遺傳改良具有十分重要的意義[15]。但是葉綠素降解酶的特性及分子生物學(xué)的研究還很少，其在降解過程中去植基的過程相當(dāng)復(fù)雜，亟需進(jìn)一步挖掘。

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Cloning and Expression Analysis ofGene in Tea Plant ()

ZHOU Zhe1,2,4, CHEN Zhidan2,3,4, WU Quanjin5, XU Yilan3, SUN Weijiang1,2,3,4*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Collaborative Innovation Center of Modern Agriculture Industrial Park of Anxi County, Quanzhou 362400, China; 3. College of Tea, Fujian Agriculture and Forestry University, Quanzhou 362400, China; 4. Engineering Technology and Research Center of Fujian Tea Industry, Fuzhou 350002, China; 5. Department of Finance and Management, The Open University of Fujian, Fuzhou 350002, China

Pheophytinase (PPH) is a key enzyme in chlorophyll degradation. It can convert pheophytin a into pheophorbide a, which is the last product to keep green in chlorophyll degradation pathway. This step is considered to be a key step of leaf senescence and yellowing. In this study, the full-length sequence ofgene was cloned from the new shoot leaves of albino tea plantcv. Baijiguan (MK359094), and its biological characteristics were analyzed. The full-length ofwas 1?298?bp, and the ORF was 1?241?bp, encoding 413 amino acids. Sequence analysis indicated that the encoded protein was a stable hydrophobic protein, and its molecular weight was predicted to be 45?741.50?Da. Its theoretical isoelectric point was 6.12. It was mainly located in chloroplasts. The real-time fluorescence quantitative PCR showed that under shading conditions, the expression ofwas inhibited, chlorophyll increased and leaf color turned green. Light promoted the expression ofin leaves of cv.Baijiguan, and chlorophyll degradation led to leaf albinism.

albinism of tea plant,gene, clone, bioinformatics analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2020)01-039-12

2019-06-10

2019-09-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31770732）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部資助項(xiàng)目——福建省安溪縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園建設(shè)（KMD18003A）、2017年福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017N3012）

周喆，女，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種與分子生物學(xué)方面的研究，742382124@qq.com。

swj8103@126.com