王明英 ,葛淑華 ,袁艷 ,刁 ★,王全杰 ,,段寶榮 ,王雪 ,欒俊
(1.煙臺大學化學化工學院,山東煙臺2 6 4 0 0 5;2.國家制革技術研究推廣中心,山東煙臺2 6 4 0 0 5)
我國是世界第一制革大國,每年皮革產量約6億平方米,約占世界的四分之一。制革業(yè)作為我國輕工業(yè)中的支柱產業(yè),每年在為我國社會發(fā)展帶來利益的同時也產生大量的廢水、廢氣和固體廢棄物,并對環(huán)境及生態(tài)平衡帶來巨大的壓力,制革廢棄物的產生和無法處理或者處理不當已經嚴重阻礙制革行業(yè)發(fā)展[1]。據(jù)統(tǒng)計,目前我國原料皮利用率只有約35%,剩下大部分以制革廢棄物的形式被丟棄。這些固體廢棄物中除了有少量的毛發(fā)、肉渣等非膠原蛋白以外,大部分是原皮修邊角料、灰皮片削皮屑等不含鉻膠原和藍革削勻、修邊等產生的含鉻膠原廢棄物,造成極大的資源浪費[2-4]。據(jù)報道,印度每年產生15萬噸的制革固體廢棄物;美國每年產生的制革廢棄物就達30萬噸(只限含鉻廢棄物);而我國每年產生的皮革固體廢棄物就達140多萬噸[5]。面對如此嚴峻的環(huán)境壓力,提高固體廢棄物的利用,使之向高值化方向發(fā)展,避免利用中的二次污染已經成為該領域的難點和熱點。
微量元素多肽螯合物的最早研究始于60年代。70年代后期,首次由美國Albion實驗室,以動植物蛋白和鐵元素為原料合成了蛋白鐵的螯合物,由此開始了蛋白或多肽螯合物的研究與開發(fā)[6-8]。對于微量元素多肽螯合物的研究,國內直到上世紀90年代初期才開始有了對它的研究。鋅是幾種植物生理過程中植物和花序的必需營養(yǎng)元素,即光合作用,呼吸作用,蛋白質、DNA、RNA和植物激素的合成[9]。缺鋅是全球植物最常見的微量營養(yǎng)素缺乏癥之一[10]。
化學肥料通常用于增加土壤中的鋅可利用性,并在營養(yǎng)液培養(yǎng)中保持該元素對植物的理想濃度[9]。農業(yè)土壤中使用的鋅的來源是無機鋅肥料、合成和天然有機螯合物[11]。無機鋅肥源在鋅質土壤中的效率相對較低,因為某些農藝限制,即沉淀為不溶性固體及其高雜質[12]。合成螯合物可以有效解決缺鋅的問題,但價格昂貴。合成螯合物載體的低降解性也是一個環(huán)境問題[13]。P.Mohammadi[14]等人合成三種鋅氨基酸螯合肥,并應用在萵苣中,結果發(fā)現(xiàn)鋅營養(yǎng)可以部分緩解鹽堿對萵苣根生長引起的損害。劉音[15]發(fā)現(xiàn)氨基酸螯合肥在促進芹菜和小白菜的生長發(fā)育、增加產量、改善品質方面具有顯著作用。張西興[16]等人以谷氨酸和硫酸鋅為原料制備出的螯合鋅肥料,螯合率可以達80%以上,在定性條件下再次證明了螯合的穩(wěn)定性。邢穎[17]等人利用乙二胺四乙酸與鋅鹽進行螯合制備出乙二胺四乙酸鋅銨,作為一種補充鋅元素的螯合肥料。Zhang[18]等人研究醇糖螯合硫酸鋅,施用在富士蘋果樹上。研究將螯合鋅肥施用可以明顯降低果實膨大期蔗糖含量,增加果實成熟期蔗糖含量;顯著提高了果實膨大期和成熟期的果糖含量和葡萄糖;使幼果期和膨大期山梨醇含量顯著降低。
鋅對植物生長有著不可忽視的作用,本文主要利用革屑制備多肽-Zn螯合物作為植物生長的肥料,既實現(xiàn)廢棄革屑的回收利用,又解決了廢棄革屑的污染問題,實現(xiàn)了其資源化利用,合成的多肽-Zn螯合物有機肥料可用于農業(yè)。
革屑:河北辛集東明皮革廠;鄰苯二甲醛:上海源葉生物科技有限公司,分析純;其他化學試劑均為分析純。
JH-752型紫外可見分光光度計:上海菁華科技儀器有限責任公司;SPD-50型自動定氮儀:上海晟聲自動化分析儀器有限公司;Nicolet 80 FTIR型傅里葉紅外光譜儀:美國;旋轉蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;SYP-D型恒溫水浴鍋:上海亞榮生化儀器廠;DHG 101-00B型恒溫恒濕箱:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;TYPE SPT12型消解儀:上海儀真分析儀器有限公司;TG16-WS型臺式高速離心機:湖南赫西儀器裝備有限公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器有限責任有限公司;JJ224BC型電子天平:常熟市雙杰測試儀器廠;Viscotek TDA305max多檢測器凝膠滲透色譜:英國Malvern儀器有限公司;AA-6880型石墨爐原子吸收光譜儀,島津企業(yè)管理有限公司。
1.2.1 不同分子量多肽的制備
稱取50 g革屑于500 mL的三口燒瓶中。液比為5∶1,NaOH用量分別為8%、15%、20%。反應溫度分別為 8℃、100℃、80℃(內溫),反應時間 6 h、8 h、10 h,反應結束后,對水解液進行離心、抽濾處理得到三種不同分子量多肽,并利用GPC測定其分子量。
1.2.2 多肽螯合Z n的制備
本探究中,利用堿水解多肽與Zn(CH3COO)2進行螯合反應,實驗流程如圖1。
對所得到的水解液進行濃縮,使其固含量在30%左右。在所得到的濃縮液中加入Zn(CH3COO)2,在一定溫度、pH和時間下將多肽-Zn螯合。用有機溶劑無水乙醇對螯合液進行沉淀處理,并進行多次沖洗以除盡Zn離子。將所得沉淀進行烘干處理,并研磨成粉末。
1.2.3 螯合率測定方法
將上述多肽-Zn螯合物用標定后的EDTA進行滴定,測定螯合鋅離子含量,進而求取螯合率。采用標準濃度為0.02 mol/L EDTA溶液進行滴定,按如下公式計算螯合率:
式中:C0——EDTA濃度(mol/L);
V0——消耗EDTA的體積(mL);
M乙酸鋅——Zn(CH3COO)2的摩爾質量;
m——獲得螯合物總質量(g);
m樣品——用于滴定的樣品質量;
m乙酸鋅——加入的無水Zn(CH3COO)2的質量(g)。
這種方法的前提是水解液中除了多肽和多肽-Zn螯合物外,幾乎沒有可溶性固體物質。
a.繪制標準曲線
取一定量鉻標液準確配制濃度梯度為0、0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/L 的標準工作液。分別將各濃度的標準工作液放入石墨爐原子吸收光譜儀(AAS)的樣品管內,測定其吸光度,并繪制標準曲線[19]。
b.樣品的制備及測定
準確稱取絕干螯合鋅0.1 g(精確到0.0001 g),置于干燥潔凈的硬質消化管中,向其中準確加入5mL濃硫酸,輕輕搖勻,管口放置彎頸小漏斗。將硬質消化管放入石墨消解爐中,保持消解爐溫度為250℃,加熱10min后取下,冷卻片刻后向其中逐滴加入2mL H2O2,將其搖勻后放回消解爐中繼續(xù)保持250℃加熱10 min,取下消化管稍冷后再次滴加2 mL H2O2,重復此操作3~4次,待消化管中樣品顏色變清亮后,繼續(xù)加熱10 min,使管內過量的H2O2分解除去。取出消化管,待管內液體冷卻后完全轉移至100 mL容量瓶內,用超純水定容,然后取1 mL溶液分兩次稀釋10000倍,配制成待測液。將待測液放入原子吸收分光光度計的樣品管內,測定其吸光度,計算鉻濃度[20,21]。
1.2.5 G P C法測定多肽水解液分子量
1.2.5.1 溶劑和樣品準備
溶劑選擇超純水。溶劑處理:采用溶劑過濾系統(tǒng)(真空過濾)對色譜純溶劑進行過濾和脫氣處理;樣品配制:取一定量樣品,用超純水溶解,攪拌過夜。樣品過濾:樣品溶解之后,采用一次微孔濾膜(孔徑0.22μm)對樣品溶液進行過濾,保存濾液待用。
綜上所述,在對PHC患者進行AFP、CA125、TK1聯(lián)合診斷后靈敏度與準確率明顯高于單獨診斷,三者能夠起到互補作用,因此聯(lián)合診斷具有較高的臨床價值,有利于早期發(fā)現(xiàn)PHC,為臨床治療PHC奠定一定基礎。
1.2.5.2 分子量測定
色譜條件:色譜柱AGuard+1 x A6000M;流動相0.1 mol/L NaNO3溶液,pH 6.0;流速 0.7 mL/min;柱溫35℃;進樣量100μL。將所述的多肽水解液用流動相配成質量濃度為1.0 mg/mL的標準樣品液,進樣量為100μL,測定其分子量。
圖1 多肽-Zn螯合工藝流程圖Fig.1 Polypeptide-Zn chelation process flow chart
在上述所得三種不同分子量的濃縮液中加入Zn(CH3COO)2,反應溫度為60℃,反應時間在60 min,多肽 -Zn質量比為 5∶1,pH 分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,在此條件下進行多肽-Zn螯合反應。用無水乙醇對螯合液進行沉淀,并進行多次沖洗以除盡游離的鋅離子。將所得沉淀進行烘干處理,并研磨成粉末。
根據(jù)以上實驗確定最佳pH,在最佳pH條件下,在上述所得三種不同分子量濃縮液中加入Zn(CH3COO)2,反應溫度為60℃,反應時間在60 mim,多肽 -Zn 比分別為 3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1,在此條件下進行多肽-Zn螯合反應。用無水乙醇對螯合液進行沉淀,并進行多次沖洗以除盡游離的鋅離子。將所得沉淀進行烘干處理,并研磨成粉末。
根據(jù)以上實驗確定最佳多肽-Zn比,在最佳pH與多肽-Zn比條件下,在上述所得三種不同分子量濃縮液中加入Zn(CH3COO)2,反應時間在60 mim,反應溫度分別為 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,在此條件下進行肽Zn螯合反應。用無水乙醇對螯合液進行沉淀,并進行多次沖洗以除盡游離的鋅離子。將所得沉淀進行烘干處理,并研磨成粉末。
根據(jù)以上實驗確定最佳反應溫度,在最佳pH、多肽-Zn比與反應溫度條件下,在上述所得三種不同分子量濃縮液中加入Zn(CH3COO)2,反應時間分別在 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min,在此條件下進行多肽-Zn螯合反應。用無水乙醇對螯合液進行沉淀,并進行多次沖洗以除盡游離的鋅離子。將所得沉淀進行烘干處理,并研磨成粉末。
因為多肽-Zn-螯合物是一種水溶性的螯合物,我們選擇用無水乙醇對其進行沉淀。其中無水乙醇的用量會影響螯合物的得率。無水乙醇的量過少的話,水就會稀釋無水乙醇,會有一部分多肽-Zn被水和無水乙醇的混合相溶解,這樣就會使多肽-Zn螯合物的得率降低。若無水乙醇過量的話,就會造成無水乙醇的浪費,故要找到合適無水乙醇用量。將上述任一條件下的多肽-Zn螯合液分成10組,每組20 mL,無水乙醇與螯合物的比例分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1,無水乙醇的用量分別對應為 40、60、80、100、120、140、160、180、200、220 mL。計算每組下的多肽-Zn螯合物的得率。
將復合多肽水解液烘干、研磨成粉末,與溴化鉀混合壓片進行傅里葉紅外光譜(FTIR)測試,利用PerkinElmer傅里葉紅外光譜儀進行測試,掃描范圍是 500 cm-1~ 4000 cm-1,分辨率為 0.5 cm-1,掃描次數(shù)為32次。
圖2 鉻含量與吸光度關系曲線Fig.2 Chromium content and absorbance curve
由圖2可以看出,鉻含量與吸光度呈較好的線性關系,鉻含量標準曲線的線性回歸方程為y=0.028x+0.00123,相關系數(shù) R2=0.99916。
結果顯示螯合鋅中的鉻含量為
根據(jù)水解度的實驗結果,本實驗采用三種不同NaOH用量,即8%、15%、20%條件進行革屑水解實驗,為下一步螯合實驗積累原料。本實驗采用GPC準確測定三種不同條件下NaOH水解革屑得到的多肽分子量,結果如表1所示。
表1 革屑水解液分子量分析Tab.1 The analysis of the molecular weight of leather hydrolyzed crumbs
從表1中可以看出,隨著NaOH用量的不斷增加,分子量呈減小趨勢。分子量分布較小,說明每種條件下所獲得的多肽分子量相差較小。三種水解條件下分子量相差較大,有利于螯合實驗的探究。
3.3.1 無水乙醇用量對螯合物得率的影響
由圖3可以看出,無水乙醇的用量較少時多肽-Zn螯合物的得率比較低,隨著無水乙醇用量的增多,乙醇沉淀螯合物的得率也在上升。當無水乙醇的用量達到一定,即無水乙醇和螯合液的體積比為8∶1時,再增加無水乙醇的用量螯合物的得率不會再上升。此時既能使螯合物的產率達到最大,也不會造成資源的浪費。
3.3.2 p H對螯合反應的影響
反應條件為:反應溫度60℃,反應時間60 min,多肽-Zn比5∶1。pH對螯合反應的影響如圖4所示。
圖3 無水乙醇的用量對得率的影響Fig.3 Effect of the amount of anhydrous ethanol on the yield
由圖4可以看出,反應體系pH對螯合反應的影響較大。在本反應體系中,當pH值為從5到8時,螯合反應的螯合率隨著pH值的增加而增加;多肽1與多肽2在pH值為8時,多肽3在pH值為7時螯合率達到最大值;當pH值大于8之后,螯合反應的螯合率隨著pH值的增加反而迅速減小,并且多肽的分子量越小,螯合率就越大,這是由于小分子量的多肽能在溶液中暴露出更多的—NH2與—COOH,增加了與Zn2+接觸的機會,從而使螯合率增加。
在本反應體系中,反應體系堿性太弱,反應體系中H+濃度增加,游離氨基會呈現(xiàn)質子化狀態(tài),阻礙與Zn2+結合,不利于螯合反應的順利進行;若反應堿性太強,體系中的Zn2+容易與OH-反應生成Zn(OH)2沉淀,消耗掉體系中的Zn2+,使Zn2+與—NH2與—COOH結合機會降低,從而使反應的螯合率降低的同時也會使產品純度降低。因此應利用鹽酸對螯合體系進行中和,以保證反應體系pH值始終維持在適宜的中等堿性范圍內,不同分子量多肽與鋅進行反應時,反應的螯合率在pH為7或8時達到最佳值,分子量從大到小螯合率依次為65.04%、67.36%、72.49%,根據(jù)反應的多肽分子量的不同,反應pH應選擇7或8。
3.3.3 肽-Z n比對螯合反應的影響
反應條件為:pH為7或者8,反應溫度60℃,反應時間60 min。肽-Zn比對螯合反應的影響如圖5所示。
圖4 pH對螯合反應的影響Fig.4 Effect of pH on the chelation reaction
由圖5可以分析出,反應的螯合率隨著乙酸鋅用量的減少而增加,當減少到一定的量時,有減小的趨勢。當多肽與Zn(CH3COO)2的質量比值為3∶1時,不同分子量的多肽表現(xiàn)出反應的螯合率較低,說明此時的Zn離子過量,大量的Zn離子未參與螯合;當提高二者比值,Zn的螯合率快速上升,多肽1與多肽2的多肽在肽鋅比達到7∶1時,多肽3的多肽在肽鋅比達到6∶1時,螯合率達到最大值,反應的螯合率達到最大值,此時再增大肽鋅比,螯合率不再上升,說明此時多肽的添加量已經飽和,繼續(xù)添加對螯合率影響不大,而且可以明顯地看到,多肽的分子量越小,螯合率就越高,這是由于小分子量的多肽能在溶液中暴露出更多的—NH2與—COOH,增加了與Zn2+接觸的機會,從而使螯合率增加,分子量從大到小螯合率依次為66.83%、75.33%、82.56%,根據(jù)反應的多肽分子量的不同,反應肽鋅比應選擇6∶1或者7∶1。
3.3.4 溫度對螯合反應的影響
反應條件為:pH為7或者8,多肽-Zn的質量比為6∶1或者7∶1,反應時間60 min。溫度對螯合反應的影響如圖6所示。
圖5 多肽-Zn比對螯合反應的影響Fig.5 Effect of polypeptide Zn ratio on chelation
由圖6可以看出,在30~60℃螯合反應的螯合率隨溫度的增加而增加,當溫度達到60℃時多肽1螯合率達到最大值,50℃時多肽2與多肽3螯合率均達到最大值。溫度可以影響螯合反應的反應速率與平衡常數(shù),螯合反應在低溫時,反應速度較慢,螯合率較低,當溫度升高時,加快螯合反應的速度,螯合率提高。這是因為適當?shù)奶岣叻磻獪囟扔欣谠黾佣嚯呐cZn離子碰撞的次數(shù),使螯合反應順利進行。然而,溫度過高時,多肽易發(fā)生羰氨反應[22],減少了Zn離子的螯合位點,而且氨基酸或小肽與金屬離子的螯合為放熱反應[23],過高的溫度反而不利于螯合。適宜的溫度范圍是50~70℃。從化學反應平衡常數(shù)來考慮,溫度過高,逆反應速率大于正反應速率,化學平衡向逆方向移動,因此得率與螯合率會下降。同時溫度升高會加快Zn離子的副反應,導致產率降低,因此螯合溫度不宜過高或過低,而且可以明顯地看到,多肽的分子量越小,螯合率就越高,這是由于小分子量的多肽能在溶液中暴露出更多的—NH2與—COOH,增加了與Zn2+接觸的機會,從而使螯合率增加,分子量從大到小螯合率依次為57.93%、74.35%、76.23%,根據(jù)反應的多肽分子量的不同,反應溫度應選擇50℃或者60℃。
3.3.5 反應時間對螯合反應的影響
反應條件為:pH為7或者8,多肽-Zn的質量比為6∶1或者7∶1,反應溫度50℃或者60℃。反應時間對螯合反應的影響如圖7所示。
由圖7可得,反應時間對螯合反應的螯合率影響較大,在一定范圍內反應的螯合率隨反應時間的增加而增加,當螯合率達到最大值時,再增加反應的時間,反應螯合率趨于平衡。反應時間在60 min的時候,螯合率達到最大值。而且可以明顯地看到,多肽的分子量越小,螯合率就越高,這是由于小分子量的多肽能在溶液中暴露出更多的—NH2與—COOH,增加了與Zn2+接觸的機會,從而使螯合率增加,分子量從大到小螯合率依次為60.02%、69.23%、72.21%,反應時間應選擇60 min。
圖6 溫度對螯合反應的影響Fig.6 Effect of temperature on the chelation reaction
采用傅里葉紅外光譜儀對不同NaOH用量水解廢革屑多肽及多肽-Zn螯合物進行表征分析,分析結果如圖8、圖9、圖10所示。
當金屬離子與包括O、N和S在內的配體原子結合時,由于配位鍵的振動,紅外光譜中的吸收峰典型地改變。因此,可以表明Zn與肽的有機基團的相互作用。三種分子量多肽和多肽-Zn螯合物的FTIR光譜顯示在圖8、圖9與圖10中。圖8中,在3428.20 cm-1處的高頻吸收指的是多肽中N—H的伸縮振動,并且螯合反應導致更低的波數(shù)3403.51 cm-1,圖9中,在3342.64 cm-1處的高頻吸收指的是多肽中N—H的伸縮振動,并且螯合反應導致更低的波數(shù)3335.90 cm-1,圖10中,在3342.19 cm-1處的高頻吸收指的是多肽中N—H的伸縮振動,并且螯合反應導致更低的波數(shù)3301.68 cm-1,這表明多肽中的N—H的電子云密度由于誘導效應或偶極場效應而變得更強[24,25]。氨基顯示增加的N—H拉伸頻率,這意味著N—H參與螯合物形成。酰胺I帶的紅外吸收主要表示由羧酸離子的伸縮振動[26]引起的C=O吸收,圖8從1649.06 cm-1移到較高的波數(shù)螯合反應后為1651.83 cm-1。在1547.85 cm-1處的帶對應于COO—轉移到1550.77 cm-1,圖9從1657.08 cm-1移到較低的波數(shù)螯合反應后為1654.88 cm-1。在1543.04 cm-1處的帶對應于COO—轉移到1550.94 cm-1,圖10從1658.88 cm-1移到較低的波數(shù)螯合反應后為1654.93 cm-1。在1543.01 cm-1處的帶對應于COO—轉移到1544.96 cm-1,這表明—COOH可能結合Zn并轉化為—COO—Zn。這種類型的螯合是固有的,因為羰基氧具有非鍵合的自由電子對來螯合Zn離子[27]。由于N—H鍵的彎曲振動和C—N鍵的拉伸,圖8在1400.22 cm-1處的弱吸收帶(代表酰胺II帶)在加入鋅之后轉移到更深的谷峰(1405.47 cm-1)。圖9在1403.92 cm-1處的弱吸收帶(代表酰胺II帶)在加入鋅之后轉移到更深的谷峰(1402.28 cm-1)。圖10在1404.17 cm-1處的弱吸收帶(代表酰胺II帶)在加入鋅之后峰強度增加(1402.27 cm-1)。指紋區(qū)域的1240.28 cm-1的峰在1139.93 cm-1處轉移至較低頻率以形成C—O—Zn,同時峰強度增強。
圖7 反應時間對螯合反應的影響Fig.7 Effect of reaction time on the chelation reaction
圖8 多肽1與多肽1-Zn紅外光譜圖Fig.8 polypeptide 1 and polypeptide 1-Zn FTIR spectrum
圖9 多肽2及多肽2-Zn紅外光譜圖Fig.9 polypeptide 2 and polypeptide 2-Zn FTIR spectrum
圖10 多肽3及多肽3-Zn紅外光譜圖Fig.10 polypeptide 3 and polypeptide 3-Zn FTIR spectrum
總體而言,峰強度和波數(shù)不同的光譜證實了多肽-鋅螯合物是一種新型化合物,與自由多肽不同。Zn主要通過羧基氧和氨基氮原子與肽結合。
本論文使用NaOH對鉻革屑進行堿水解,然后將水解液進行濃縮處理,對濃縮液和Zn(CH3COO)2在不同條件下進行螯合。根據(jù)條件的不同,設計單因素實驗,得到如下結論。
無水乙醇和螯合液的體積比為8∶1時,再增加無水乙醇的用量螯合物的得率不會再有所上升。此時既能使螯合物的產率達到最大,也不會造成無水乙醇的浪費。對于三種不同分子量水解多肽最佳的螯合反應條件有所差異,多肽1分子量為2995,反應pH為8,多肽與Zn(CH3COO)2質量比為7∶1,反應溫度60℃,反應時間60 min,螯合率最高為66.83%。多肽2分子量為1026,反應pH為8,多肽與Zn(CH3COO)2質量比為7∶1,反應溫度60℃,反應時間60 min,螯合率最高為75.33%。多肽3分子量為680,反應pH為7,多肽與Zn(CH3COO)2質量比為6∶1,反應溫度60℃,反應時間60 min,螯合率最高為82.56%。利用紅外對肽鋅螯合物進行表征,結果可以證明多肽與鋅進行了螯合反應,形成比較穩(wěn)定的肽鋅螯合物。
對于多肽與Zn的螯合,不僅可以促進生物體對Zn的生物利用度,作為農業(yè)有機肥料成本較低,而且更好地使得皮革固體廢棄物回收利用,減少皮革廢棄物對環(huán)境的污染,促進制革行業(yè)的發(fā)展。實驗條件及其結果對于其他微量元素與多肽的螯合物制備具有一定參考價值。