杜娟娟 董仙蘭 趙國洪 李朝 李紅霞*

（1，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 650201； 2，玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 653106）

剛地弓形蟲 （Toxoplasma Gondii） 是一種在全球分布廣且危害較大的人畜共患專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲[1]。 其宿主范圍極廣，除人之外還包括鴿子及其他溫血動物[2]。 鴿子感染弓形蟲常呈亞臨床癥狀或無臨床癥狀[3]，有相關(guān)研究表明，從鴿體內(nèi)分離得到的弓形蟲可以感染其他動物，說明鴿子也是弓形蟲重要的傳播宿主[4，5]。 弓形蟲感染不僅會對養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，同時對人體健康也構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]。 據(jù)報道，我國平均弓形蟲陽性率為7.88%[7]，鴿子作為食用動物，弓形蟲感染對人類安全的威脅不容忽視。

玉溪地區(qū)是云南重要的鴿子養(yǎng)殖產(chǎn)地，目前還未見有關(guān)云南地區(qū)鴿子弓形蟲感染情況的相關(guān)報道。 弓形蟲的感染率可以間接反映人們居住環(huán)境中 （土壤、水） 弓形蟲卵囊的含量[8]，因此，對該地鴿子進(jìn)行弓形蟲檢測具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本文運(yùn)用IHA 和巢式PCR 兩種檢測方法對該地鴿子進(jìn)行弓形蟲檢測，能準(zhǔn)確掌握鴿子弓形蟲的感染情況，為鴿子弓形蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和采集

采集云南玉溪地區(qū)的鴿子血樣共計100 份。 3000r/min 離心10min，吸取血清置于-20℃冰箱備檢。

1.2 主要試劑

弓形蟲抗體間接血凝 (IHA) 檢測試劑盒 (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)，血液DNA 提取試劑盒 （天根公司），PCR 試劑 （大連寶生物公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血清檢測法

參照弓形蟲抗體間接血凝 (IHA) 檢測試劑盒的說明書，結(jié)果判定，陽性對照血清的血清效價高于或等于1:1024，另外，陰性血清對照和稀釋液對照各孔均為 “-” （陰性血清對照第1孔可以有前滯現(xiàn)象，其余孔不可以有） 的前提下，判定待檢血清效價高于或等于1:64 的為陽性，陽性終點(diǎn) “++”。

1.3.2 巢式PCR 方法檢測

（1） 擴(kuò)增弓形蟲的 SAG3 基因

根據(jù)Grigg 等[9]發(fā)表的弓形蟲SAG3 基因特異巢式PCR 引物對所有樣品進(jìn)行檢測。 外引物序列： P43S1:5'-CAACTCTCACCATTCCACCC-3'，P43AS1:5'-GCGCGTTGTTAGACAAGACA-3'； 內(nèi)引物序列： P43S2:5'-TCTTGTCGGGTGTTCACTCA-3'，P43AS2:5'-CACAAGGAGACCGAGAAGGA-3'。 目的片段大小為225bp。

（2） DNA 提取與巢式 PCR 檢測

參照血液DNA 提取試劑盒的使用說明書提取DNA，以提取的DNA 為模板進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增。 第一輪反應(yīng)總體積為25μL，其中 10×buffer2.5μL，dNTP 2μL，MgCl22μL，引物各0.15μL，模板 1.5μL，Taq 酶 0.2μL，于 94℃預(yù)變性 5min 后進(jìn)入循環(huán)，94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 30s，30 個循環(huán)后 72℃延伸5min。 第二輪反應(yīng)體系同第一輪，于94℃預(yù)變性5min 后進(jìn)入循環(huán)，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35 個循環(huán)后 72℃延伸5min，同時設(shè)立陰陽性對照。

取4μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳約20min 后于紫外透射儀中觀察，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 IHA檢測結(jié)果

207 份血清樣品中檢出13 份陽性血清，包括成年鴿血清陽性1 份，幼年鴿血清陽性12 份，總陽性率為6.28%，成年鴿和幼年鴿的血清陽性率之間無顯著差異 （ =0.470＞0.05）。 見表1。

表1 不同年齡的鴿子弓形蟲感染的血清陽性率

2.2 巢式PCR檢測結(jié)果

用巢式PCR 檢測了對應(yīng)13 份血清陽性樣品的血液DNA，檢出1 份陽性，陽性率為7.69%。 將PCR 產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序，將測序的拼接結(jié)果在Blast 上比對分析，樣本的序列與GenBank 上公布的剛地弓形蟲 （T.gondii） 相似性為100%。該對比結(jié)果表明，該幼年鴿感染的是剛地弓形蟲。 巢式PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果見附圖。

2.3 巢式PCR與IHA檢測結(jié)果

IHA 檢測的血清陽性率為6.26%，巢式PCR 檢測的陽性率為7.69%，見表 2。

表2 不同檢測方法的陽性率比較

3 討論

鳥類感染弓形蟲的途徑主要是吞食環(huán)境中成熟的弓形蟲卵囊。 經(jīng)了解養(yǎng)殖場周圍常有野貓出入，貓作為弓形蟲的終末宿主，其身上可能攜帶弓形蟲病原體，出入養(yǎng)殖場過程中，其排出的糞便可能會污染喂食鴿子的飼料及飲用水等。 且年齡因素與鴿子感染弓形蟲無相關(guān)性，一旦誤食帶有弓形蟲卵囊的飼料均會感染弓形蟲。 因此，制定驅(qū)蟲程序時應(yīng)雙管齊下，防止進(jìn)一步擴(kuò)大弓形蟲感染。 飼料應(yīng)進(jìn)行煮熟加工處理，飲用水也應(yīng)煮沸消毒后再投喂； 嚴(yán)格防止野貓出入，做好滅鼠工作的同時定期對鴿子進(jìn)行檢測和驅(qū)蟲。

通過IHA 檢測結(jié)果我們可獲悉，該地鴿子存在弓形蟲感染。 但本次調(diào)查結(jié)果顯示，IHA 檢出的13 份陽性樣品用巢式PCR 僅檢出1 份陽性，由弓形蟲的生活史可知，弓形蟲主要以緩殖子的形式存在于宿主組織器官中，短期內(nèi)發(fā)育為速殖子隨血液循環(huán)到達(dá)機(jī)體其他器官，血液中便不再有弓形蟲抗原[10]，因此，通過巢式PCR 檢測可能出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。 IHA 檢測結(jié)果僅能為弓形蟲病血清學(xué)檢測提供參考依據(jù)，并不能完全確定被檢鴿子是否攜帶有弓形蟲病原體，將血清學(xué)檢測方法和巢式PCR檢測方法結(jié)合使用能更準(zhǔn)確地掌握鴿子弓形蟲的感染情況。

本次調(diào)查主要針對云南玉溪地區(qū)的鴿子，目前國內(nèi)關(guān)于鴿子弓形蟲的研究還較少，可參見姚秋霞等[11]、Yan C[12]、Wei Cong[13]、L Ma[14]的鳥類和禽類弓形蟲感染情況的報道，血清陽性率分別為34.28%、8.7%、11.86%、17.6%。 從上述報道看出，鳥類弓形蟲病雖相較于哺乳動物來說更為少見，但全國大部分地區(qū)仍存在禽類和鳥類弓形蟲的感染。 鳥類活動范圍廣泛，更易接觸到弓形蟲病原體，對人類和其他動物構(gòu)成潛在的感染風(fēng)險，需引起重視。 由于本次試驗(yàn)樣本量少，該試驗(yàn)結(jié)果僅能反映局部流行情況，但加強(qiáng)玉溪乃至整個云南省鴿子飼養(yǎng)管理及弓形蟲病綜合型防控顯得十分必要。