王鵬程，張 冉，陳立華，徐 丹，羅向波，黃維亮

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013；2.長沙市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，長沙 410005）

艾滋病患者因?yàn)椴《狙Y控制不佳、抗病毒藥物的副作用等原因［1，2］，比非艾滋病患者面臨更高的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。心型肌酸激酶（CK-MB）是肌酸激酶（CK）同工酶之一，具有良好的心肌組織特異性［3］，是艾滋病患者最常用的心肌損傷標(biāo)志物。目前國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室多采用免疫抑制法定量檢測(cè)CK-MB 活性。替諾福韋是高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的主流藥物，屬于核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，主要用于艾滋病患者和乙型肝炎患者的抗病毒治療。富馬酸替諾福韋二吡呋酯（TDF）是替諾福韋的前體藥之一。據(jù)報(bào)道［4，5］，TDF 治療艾滋病導(dǎo)致患者體內(nèi)廣泛型線粒體CK（uMtCK）形成，對(duì)免疫抑制法檢測(cè)的CK-MB 活性造成干擾，但國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。CK-MB 質(zhì)量濃度檢測(cè)是一種定量檢測(cè)方法，不受溶血、巨CK 的干擾［6］。本文采用回顧性分析的方法，在采用免疫抑制法監(jiān)測(cè)艾滋病患者心肌損傷的同時(shí)，利用剩余血清檢測(cè)CK-MB 質(zhì)量濃度，研究口服TDF 對(duì)心型肌酸激酶檢測(cè)的影響，為臨床實(shí)驗(yàn)室CK-MB 檢測(cè)方法選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2019 年9 月～2019 年12 月在長沙市第一醫(yī)院HIV 門診就診的患者，所有患者均符合《中國艾滋病診療指南（2018 版）》關(guān)于艾滋病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療6 個(gè)月以上。

1.2 方法

1.2.1 門診病歷資料收集 在醫(yī)院信息系統(tǒng)中查詢患者歷次門診病歷資料，收集患者性別、年齡等基本信息，以及6 個(gè)月內(nèi)的用藥史、心血管疾病史等病歷資料。

1.2.2 分組設(shè)計(jì) 根據(jù)患者HAART 方案中是否含有TDF 將其分為TDF 組和非TDF 組。分組標(biāo)準(zhǔn)：HAART方案中不含TDF 的患者，或曾經(jīng)用過TDF 但己停用 3個(gè)月以上者，納入非TDF 組；HAART 方案中含TDF，且服用TDF 1 月以上者納入TDF 組。

1.2.3 疫抑制法檢測(cè)CK-MB 活性 患者采血后，室溫放置30 min，水平離心機(jī)3000 r/min 離心5 min 分離血清，使用雅培C16000 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清CK-MB 活性，檢測(cè)方法為分光光度計(jì)比色法，檢測(cè)原理為免疫抑制法，即利用針對(duì)M 亞基的特異性抗體屏蔽樣本中M 亞基的活性，測(cè)得的B 亞基活性乘以2。CK-MB 活性實(shí)驗(yàn)室參考范圍為0～24 U/L。檢測(cè)試劑及質(zhì)控品由寧波美康生物生產(chǎn)，校準(zhǔn)品由朗道生物生產(chǎn)。檢測(cè)完成后將血清凍存于-80℃冰箱內(nèi)，用于CK-MB質(zhì)量濃度測(cè)定。

1.2.4 CK-MB 質(zhì)量濃度測(cè)定 室溫解凍凍存血清，使用深圳華邁興微醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的MF05 半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)CK-MB 質(zhì)量濃度，檢測(cè)方法為微流控磁微粒化學(xué)發(fā)光法，該方法將雙抗體夾心法與化學(xué)發(fā)光法相結(jié)合，采用微流控芯片，以磁微粒為固相載體，加入樣本后，形成“磁微粒標(biāo)記抗體-CKMB 抗原-AP 標(biāo)記抗體”的三明治結(jié)構(gòu)復(fù)合物，通過檢測(cè)該復(fù)合物在發(fā)光基底液中的發(fā)光強(qiáng)度值，計(jì)算樣本中CK-MB 質(zhì)量濃度。CK-MB 質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)室參考范圍為0-5μg/L。檢測(cè)試劑、質(zhì)控品、校準(zhǔn)品均由華邁興微醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism8 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的差異比較使用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料結(jié)果用率（%）表示，兩組間的差異比較使用卡方檢驗(yàn)，兩因素間的相關(guān)性分析使用線性相關(guān)法。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 選取的170 例HIV 門診患者治療規(guī)律，病情穩(wěn)定，近6 個(gè)月內(nèi)無心肌損傷的病史記錄。其中，有8 例患者應(yīng)用TDF 治療不足1 個(gè)月，未進(jìn)入統(tǒng)計(jì)。納入TDF 組114 例，納入非TDF 組48 例。兩組性別、年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見表1。

2.2 兩組間CK-MB 活性及CK-MB 質(zhì)量濃度比較 TDF 組CK-MB 活性為45.99±21.08 U/L，非TDF 組CK-MB 活性為14.21±3.27 U/L，兩組間比較差異有顯著性（P<0.0001），TDF 組CK-MB 質(zhì)量濃度為1.61±1.13μg/L，非TDF 組CK-MB 質(zhì)量濃度為1.86±0.93μg/L，兩組之間比較差異無顯著性（P>0.05），見表2。

表1 兩組人口學(xué)資料比較

表2 兩組間CK-MB活性及CK-MB質(zhì)量比較

2.3 CK-MB 活性與CK-MB 質(zhì)量相關(guān)性分析 非TDF 組CK-MB 活性與CK-MB 質(zhì)量濃度之間具有高相關(guān)性（r =0.963），TDF 組CK-MB 活性與CK-MB 質(zhì)量濃度之間無相關(guān)性（r =0.094），見圖1。

圖1 兩組CK-MB活性與CK-MB質(zhì)量相關(guān)關(guān)系

3 討論

CK-MB 可用于診斷急性冠脈綜合征和病毒性心肌炎，臨床應(yīng)用廣泛。CK-MB 有多種測(cè)定方法。瓊脂糖凝膠電泳能夠很好地區(qū)分CK 同工酶，曾長期作為CKMB 測(cè)定的參考方法，但其敏感性低，對(duì)低濃度的CKMB 定量不準(zhǔn)確，而且操作煩瑣，耗時(shí)長，不利于臨床診斷；免疫抑制法大大提高了CK-MB 測(cè)定的敏感性，操作簡單，檢測(cè)迅速，但容易受溶血和巨CK 的干擾；CKMB 質(zhì)量濃度測(cè)定常采用化學(xué)發(fā)光法，不受溶血和巨CK 的影響，能準(zhǔn)確定量，但成本高。本研究中，TDF 組CK-MB 活性明顯高于非TDF 組，但兩組間CK-MB 質(zhì)量濃度差異不大，且TDF 組CK-MB 活性與CK-MB 質(zhì)量濃度無相關(guān)性，間接證實(shí)了uMtCK 對(duì)CK-MB 活性檢測(cè)的干擾作用。因此，在臨床工作中，治療規(guī)律、病情相對(duì)穩(wěn)定的艾滋病患者和乙型肝炎患者出現(xiàn)CK-MB活性顯著升高，應(yīng)當(dāng)先明確治療方案中是否含有替諾福韋前體藥或復(fù)方制劑，以避免不必要的檢查，加重患者經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。

替諾福韋治療后，uMtCK 導(dǎo)致血清CK-MB 活性假性升高，屬于系統(tǒng)誤差，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行糾正。除外成本因素，用CK-MB 質(zhì)量濃度測(cè)定代替常規(guī)心肌酶譜中的CKMB 活性檢測(cè)是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。同時(shí)，線粒體CK 和胞質(zhì)CK 具有不同的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，表面靜電電位和疏水性存在差異，因此可以開發(fā)出針對(duì)線粒體CK 的特異性抗體，對(duì)目前臨床實(shí)驗(yàn)室使用的CK-MB 活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行改良。Hoshino 等［7］在CK-MB 試劑盒中，同時(shí)添加針對(duì)M 亞基的抑制性抗體和針對(duì)線粒體CK的抑制性抗體，替代單一針對(duì)M 亞基抑制性抗體，取得了良好的效果，但該方法的臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。 本研究只證明了uMtCK 對(duì)CK-MB 檢測(cè)的干擾作用，沒有定量測(cè)定患者的uMtCK。uMtCK 位于線粒體嵴和線粒體內(nèi)外膜之間，分子量大，為2 型巨CK，在外周血中含量極低［8，9］。據(jù)報(bào)道［10，11］，uMtCK 升高主要見于腫瘤患者，可能與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)。Uranbileg 等的研究［12］發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中uMtCK mRNA 和蛋白表達(dá)增加，但在該患者的非腫瘤肝組織中表達(dá)正常。替諾福韋治療導(dǎo)致uMtCK 升高的機(jī)制尚不明確，Maria Saumoya 等［13］在研究一例經(jīng)替諾福韋治療后發(fā)生腎損傷的HIV 感染者時(shí)發(fā)現(xiàn)，該患者外周血單個(gè)核細(xì)胞、口腔黏膜細(xì)胞、毛囊細(xì)胞線粒體DNA 含量降低，停藥后線粒體DNA 含量逐步回升，Milian 等的研究［14］發(fā)現(xiàn)替諾福韋在細(xì)胞內(nèi)累積引發(fā)線粒體毒性，影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力，這引起研究表明艾滋病患者化療后血清uMtCK 升高的機(jī)制可能與腫瘤患者不同。Schmid 等的研究［15］認(rèn)為艾滋病患者化療后血清uMtCK 升高可能與輕微的線粒體損傷、uMtCK 代償性表達(dá)增加、替諾福韋對(duì)uMtCK 空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用有關(guān)?？傊诜嬷Z福韋會(huì)導(dǎo)致外周血uMtCK 升高，干擾免疫抑制法檢測(cè)CK-MB 活性，導(dǎo)致假性升高，但uMtCK 升高的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。