姚鳳騰 董玉瑋

摘要：微生物反應的動力學模型的建立，能夠在發(fā)酵過程中放大試驗數(shù)據(jù)，提供最佳的控制和模擬，也為分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵的過渡提供了理論基礎。本試驗選擇杏鮑菇菌株，使用牛蒡皮作為基質(zhì)，采用固體發(fā)酵方法培養(yǎng)杏鮑菇菌株，以檢測菌絲多糖和三萜類化合物的含量。建立了牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇在不同溫度、時間和限制基質(zhì)條件下的動力學模型，并對模型參數(shù)進行了非線形回歸分析。不同培養(yǎng)時間下，用Logistic模型擬合杏鮑菇生長狀況，多糖最高增長量為0.612 6 mg/（g·d），三萜最高增長量為0.645 1 mg/（g·d）。在基質(zhì)限定條件下，Logistic模型和統(tǒng)一動力學方程均能較好擬合。在不同溫度下，Lorentz模型得出多糖增長量最高時，最適生長溫度為28.43 ℃，三萜增長量最高時，最適生長溫度為28.72 ℃。所建數(shù)學模型能較好地描述實際的固體培養(yǎng)過程，為快速有效地采用牛蒡皮固體培養(yǎng)杏鮑菇提供了理論依據(jù)和技術支撐。

關鍵詞：牛蒡皮;杏鮑菇;動力學模型;固體發(fā)酵;多糖;三萜

中圖分類號： TS201.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0144-04

牛蒡是一種具有較高營養(yǎng)價值的根莖植物，含有豐富的營養(yǎng)成分，包括纖維素、胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、金屬離子以及多種氨基酸和維生素。牛蒡可供藥食，在所有地下根莖類的蔬菜中，膳食纖維含量是最高的[1]。牛蒡根藥性味苦、性寒、可清熱、祛風，可以幫助加快新陳代謝、清除腸胃中殘留的垃圾、促進血液的流通、降低膽固醇、降低血糖濃度、防止高血脂和高血壓[2-3]。杏鮑菇（Pleurotus eryngii），因具有杏仁香味和鮑魚口感而得名，隸屬擔子菌門、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[4]。杏鮑菇富含蛋白質(zhì)、人體必需的各種氨基酸[5]和極其豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖、脂類、多肽、三萜等[6]，具有降血糖、降血脂、增強人體免疫力、美容養(yǎng)顏等功效[7]。

由于牛蒡皮中難以再利用的纖維素含量較高，牛蒡皮通常被當作廢棄物丟掉，而微生物尤其是一些藥用真菌如杏鮑菇等，具有分解、利用纖維素的能力。為了充分利用這類廢棄物，本研究以牛蒡皮為固體培養(yǎng)基，精心選取優(yōu)良杏鮑菇菌株，采用固體發(fā)酵技術，結(jié)合經(jīng)典微生物動力學模型理論，確立多糖和三萜類產(chǎn)量增長的發(fā)酵動力學參數(shù)，并建立相應的數(shù)學模型，為以后快速有效地培養(yǎng)杏鮑菇提供了理論依據(jù)和技術支撐。已有10多種方程可用來描述生物化學動力學方面的底物變化或生物增長過程的變化，例如，Logistic模型是一個非線性方程，通常用于表達細胞的生長和營養(yǎng)物之間的關系，并且曲線通常是S形。對于細菌的生長、細菌濃度的增加和它自己增長的關系，可用Logistic模型進行擬合，培養(yǎng)時間不同時，Logistic模型也具有一定的適用性[8]。然而，每個方程有自己的缺點，不能被廣泛應用到各種領域。如何統(tǒng)一這些方程是一個亟待解決的問題。張艷秋基于酶動力學原理，通過數(shù)學推導，提出了一個新的基本生化反應動力學方程[9]，幾乎涵蓋了所有現(xiàn)有的動力學方程。這個方程結(jié)合現(xiàn)有的動力學方程，被稱為統(tǒng)一動力學方程。目前，對使用相關模型，研究食用菌的發(fā)酵過程還沒有相關報道。

這項研究將有助于進一步了解發(fā)酵過程中菌絲生長和產(chǎn)品形成，以及影響這些產(chǎn)物的環(huán)境因素，并為有效控制菌種的整個發(fā)酵過程提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇菌種：為筆者實驗室保存的高產(chǎn)多糖菌株;原料：牛蒡由徐州天馬敬安食品有限公司提供;試劑：提取與檢測試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

HH.B12.601-S-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠;FA21240電子天平，精密科學儀器（上海）有限公司;150B生化培養(yǎng)箱，國華電器（常州）有限公司;W14646分光光度計，上海欣茂儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋，國華電器（常州）有限公司;SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術有限公司;IXQ-SG45-280A蒸汽滅菌鍋，上海訊博實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;FSD-101A電動粉碎機，新恩精密糧儀（臺州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 PDA 培養(yǎng)基：去皮甘薯 200 g/L，瓊脂 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，酵母膏 3 g/L，KH2PO4 3 g/L，少量維生素B1。

1.3.2 杏鮑菇菌種的活化 先配制PDA 培養(yǎng)基，然后活化杏鮑菇菌種，28 ℃下培養(yǎng) 7 d。

1.3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)杏鮑菇

1.3.3.1 培養(yǎng)溫度 粉碎牛蒡皮至5 mm長度，以20 g/250 mL為裝瓶量，將牛蒡皮裝入瓶中，高壓滅菌20 min。將已活化的杏鮑菇菌種轉(zhuǎn)接于牛蒡皮固體培養(yǎng)基中，分別在22、25、28、31 ℃下培養(yǎng)15～20 d，至菌絲體鋪滿培養(yǎng)基，菌絲體于60 ℃烘箱中烘干備用。

1.3.3.2 培養(yǎng)時間 粉碎牛蒡皮至5 mm長度，以20 g/250 mL為裝瓶量，將牛蒡皮裝入瓶中，高壓滅菌20 min。將已活化的杏鮑菇菌種轉(zhuǎn)接于牛蒡皮固體培養(yǎng)基中，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第3、5、7、9、10、11、13、15、17、19、21天，對菌絲體進行多糖和三萜的提取和測定。

1.3.3.3 培養(yǎng)基質(zhì) 粉碎牛蒡皮至5 mm長度，以20 g/250 mL為裝瓶量，將牛蒡皮裝入瓶中，高壓滅菌20 min。將已活化的杏鮑菇菌種轉(zhuǎn)接于牛蒡皮固體培養(yǎng)基中，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第3天起，每隔6 h或12 h取出，對菌絲體進行多糖和三萜的提取和測定。

1.3.4 杏鮑菇多糖的提取與測定[10-11]

1.3.4.1 標準曲線繪制 精確稱取無水葡萄糖0.500 0 g，至100 mL容量瓶稀釋定容，取溶液1 mL于50 mL容量瓶，定容。 2.50 mL容量瓶中分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，至試管，每樣平行3次，分別加入2 mL的蒸餾水、1 mL的6%苯酚和 5 mL 的濃硫酸，混勻，放在沸水浴中加熱15 min，然后冷卻。分光光度計測量490 nm處的吸光度。標準曲線方程為y=0.014 5x+0.014 7，r2=0.992 9。

1.3.4.2 提取方式 首先用熱水溶解。粉碎子實體，按照 1 g 子實體10 mL 純水的比例，在 40 ℃水浴鍋溶解過夜，離心取其上清液，離心條件設置為 4 000 r/min，離心時間 5 min。加入上清液5 倍體積的95%乙醇，靜置過夜，取出后4 000 r/min，離心 5 min，棄上清，沉淀為粗多糖。

1.3.4.3 測定方法 粗多糖含量測定采用苯酚-硫酸法。先將多糖樣品加水定容 100 mL，取 2 mL 待測樣品放在試管中，加 1 mL 濃度為 6% 苯酚，5 mL 濃硫酸，充分搖勻，靜置 5 min，放入 100 ℃水浴鍋中水浴15min，冷水冷卻，490 nm下測定吸光度，按上述葡萄糖標準曲線方程計算粗多糖含量。

1.3.5 三萜的提取與檢測[12]

1.3.5.1 繪制標準曲線 取干凈試管7支，分別取20、40、60、80、100、120、140 μg的齊墩果酸，放入試管內(nèi)。向7支試管中加入現(xiàn)配制的0.3 mL香草醛和1.0 mL高氯酸，振蕩混勻，60 ℃水浴20 min，冷卻 15 min，再加入5 mL冰醋酸，于波長550 nm處測定吸光度。標準曲線方程為y=0.004 9x-0.009 2，r2=0.998 3。

1.3.5.2 提取方式 取烘干后菌絲體粉碎，取1 g于燒杯中，加50 mL甲醇，靜置，溶解過夜。過濾溶解液，60 ℃水浴加熱，直至蒸干液體，再倒入40 mL無水乙醇至燒杯中，使其溶解。

1.3.5.3 測定方法 三萜檢測采用香草醛-高氯酸比色法。取溶解液1 mL至試管中，依次加入 2 mL 5%香草醛、5 mL高氯酸，混合均勻之后，在 60 ℃ 水浴20 min，冷卻15 min，加入冰醋酸5 mL，于波長550 nm處測定其吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)、方程擬合并作圖，所有數(shù)據(jù)用x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖和三萜類增長量隨溫度變化的模型

杏鮑菇多糖和三萜增長量會隨溫度變化，采用Origin 9.0軟件中的Lorentzian 模型，對測定的多糖和三萜數(shù)據(jù)分別進行擬合，結(jié)果見圖1、圖2。

由圖1、圖2可知，在28 ℃時，杏鮑菇多糖和三萜增長率最高，小于或大于28 ℃時，杏鮑菇多糖、三萜增長率會下降，說明在28 ℃是杏鮑菇生長最旺盛。由圖1可知，杏鮑菇的最適生長溫度為28.43 ℃（r2=0.997 4），實際培養(yǎng)最佳溫度為 28 ℃，實際值與預測值接近。參數(shù)估計為：y0=-3.340 7，x0=28.428 8，w=51.003 7，A=297.025 2。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，P=0.009 29<0.05，說明用自變量預測因變量結(jié)果可信;F=6 256.9遠大于1，說明各組數(shù)據(jù)間的差異極顯著，有統(tǒng)計學意義。因此不同溫度下多糖產(chǎn)量增長的動力學過程可以用該方程描述。

由圖2可知，杏鮑菇的最適生長溫度為 28.72 ℃（r2=0.990 2），實際培養(yǎng)最佳溫度為 28 ℃，實際值與預測值非常接近。參數(shù)估計為：y0=0.609 2，x0=28.716 4，w=6.348 5，A=3.342 6。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，P=0.003 15<0.05，說明用自變量預測因變量結(jié)果可信;F=54 578.2遠大于1，說明各組數(shù)據(jù)間的差異極顯著，有統(tǒng)計學意義。因此可以用該方程描述不同溫度下多糖含量的動力學過程。推測當溫度≤25 ℃時，酶活性較低，多糖與三萜的合成途徑受到抑制;溫度≥31 ℃，酶失活，多糖與三萜合成途徑受到抑制;28 ℃左右，酶活性較高，多糖與三萜產(chǎn)量增高。

2.2 多糖和三萜類增長量隨時間變化的模型

杏鮑菇多糖和三萜增長量會隨時間變化，采用Origin 9.0軟件中的Logistic模型，對測定的多糖和三萜數(shù)據(jù)分別進行擬合，結(jié)果見圖3、圖4。

從圖3、圖4可以看出，在發(fā)酵前6 d，菌絲體處于生長適應期，長勢較慢;第6～15天，菌絲體處于對數(shù)生長期，呈幾何數(shù)增長;發(fā)酵第15～21天，菌絲體處于穩(wěn)定期，生長速率下降，并逐漸趨于平緩。從圖3可看出，Logistic模型相關系數(shù)r2為 0.996 5，達極顯著水平，概率值P<0.01，說明擬合方程與試驗數(shù)據(jù)很吻合，F(xiàn)=2 2937.7，遠大于1，說明各組數(shù)據(jù)間存在極顯著差異，有統(tǒng)計學意義，可以使用此模型模擬牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇生成多糖的生長動態(tài)。

從圖4可看出，Logistic模型擬合出的曲線相關系數(shù)r2為0.999 6，達極顯著水平，概率值P<0.01，說明擬合方程與試驗數(shù)據(jù)很吻合，F(xiàn)=707 008.1，遠大于1，說明各組數(shù)據(jù)間存在極顯著差異，有統(tǒng)計學意義，可以使用此模型模擬牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇合成三萜的生長動態(tài)。

2.3 限定基質(zhì)對多糖和三萜類增長量的影響

限定基質(zhì)下測得杏鮑菇多糖和三萜增長量，采用Origin 9.0軟件中的Logistic模型，對測定的多糖和三萜數(shù)據(jù)分別進行擬合，結(jié)果見圖5、圖6。

從圖5可以看出，采用Logistic模型擬合的相關系數(shù)r2為0.995，達顯著水平，F(xiàn)值遠大于1，說明各組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義。采用統(tǒng)一動力學模型擬合的曲線的相關系數(shù)r2為0.980，達到顯著水平，F(xiàn)遠大于1，說明擬合的方程與試驗的數(shù)據(jù)點也較吻合，也可以使用統(tǒng)一動力學方程模擬杏鮑菇的生長動態(tài)。

從圖6可以看出，用Logistic模型擬合出的相關系數(shù)r2為0.994，達顯著水平，F(xiàn)大于1，說明各組數(shù)據(jù)間存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義。其中，用統(tǒng)一動力學方程擬合的曲線的相關系數(shù)r2為0.949，達顯著水平，F(xiàn)大于1，說明擬合方程與試驗數(shù)據(jù)點較吻合，可以使用統(tǒng)一動力學方程模擬牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇產(chǎn)生三萜的增長量。由圖5、圖6擬合模型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)比較，Logistic模型擬合的效果較統(tǒng)一動力學模型要好，因此可以用Logistic模型擬合在有限的基質(zhì)條件下牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇生長所產(chǎn)生的多糖和三萜增長量。

3 結(jié)論

根據(jù)不同溫度下多糖和三萜類含量增長率的測定結(jié)果，采用Lorentz方程擬合，最適生長溫度分別為28.43 ℃和28.72 ℃。根據(jù)多糖和三萜類含量增長率隨培養(yǎng)時間變化的測定結(jié)果，采用Logistic模型擬合，菌絲體生長第6～15 d，多糖和三萜類含量增長速度最快。根據(jù)限定基質(zhì)條件下菌絲體多糖、三萜類的增長率，采用Logistic模型和統(tǒng)一動力學模型同時擬合，由擬合結(jié)果可知，相比動力學模型，Logistic模型擬合效果更好，具有更高的準確性，對菌絲體生長和反應狀況具有指導意義。

參考文獻：

[1]馬利華，秦衛(wèi)東，陳學紅，等. 擠壓膨化對牛蒡膳食纖維提取及加工特性影響的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（8）：240-244.

[2]朱丹實，梁潔玉，李 慧，等. 響應面設計對牛蒡無糖保健飲料口味的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（21）：231-235.

[3]王海鷗，扶慶權，陳守江，等. 不同真空冷凍干燥方法對杏鮑菇片干燥特性及品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2018，34（4）：904-912.

[4]胡汝曉. 我國杏鮑菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與建議[J]. 中國食用菌，2016，35（5）：1-5.

[5]Hu Ru Xiao. Development status and suggestions of Pleurotus eryngii industry in China[J]. Edible Fungi of China，2016，35（5）：1-5.

[6]Ke L Q，Zhang D X，Xiao J Z. Optimization of microwave-assisted enzyme extraction process of polysaccharide from Pleurotus eryngii stalk residue after deep treatment[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，2014，33（21）：332-338.

[7]Liu X N，Zhou B，Lin R S，et al. Extraction and antioxidant activities of intracellular polysaccharide from Pleurotus sp. mycelium[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2010，47（2）：116-119.

[8]吳喜之. 復雜數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法[M]. 第二版，北京：中國人民大學出版社，2013. 47-54.

[9]張雁秋，李 昂，李 燕，等. 分點進水脫氮除磷新工藝的理論基礎和實踐[J]. 中國給水排水，2008，24（24）：13-15.

[10]伍善廣，馮學珍，陳 穎，等. 柱前衍生高效液相法測定杏鮑菇多糖的單糖組成[J]. 食品工業(yè)，2014，35（5）：245-247.

[11]羅懿洋，任道遠，陳麗芳，等. 杏鮑菇多糖的單糖組成分析及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（8）：158-161.

[12]李 曄，朱忠敏，姚渭溪等. 靈芝三萜化合物的研究進展[J]. 中國中藥雜志，2012，37（2）：165-170.王 倩，張長青，李廣平，等. 基于UPLC-QTOF/MS的藍莓果實發(fā)育代謝組學差異分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（24）：148-152，197.