李一平，任華

西安市大興醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710016

出生缺陷已成為影響兒童健康和出生人口素質(zhì)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，其中染色體疾病是嬰幼兒出生缺陷的重要原因。傳統(tǒng)的染色體核型分析是染色體疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]，可準(zhǔn)確檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目異常及倒位、易位等結(jié)構(gòu)異常，但該技術(shù)培養(yǎng)周期長(zhǎng)、操作要求高、易失敗，對(duì)5Mb以下的染色體缺失/重復(fù)無(wú)法正確檢出。事實(shí)上，這些缺失/重復(fù)往往會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，如生長(zhǎng)發(fā)育異常、智力遲緩、特殊面容、內(nèi)臟器官畸形、內(nèi)分泌異常、精神行為改變等[2,3]。微缺失/微重復(fù)綜合征出生后診斷相對(duì)容易，但幾乎沒(méi)有有效的治療方法。因此，產(chǎn)前診斷的臨床意義重大。細(xì)菌人工染色體微球技術(shù)(bacterial artificial chromosomes-on-beads，BoBs)無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)、高通量，能夠快速檢測(cè)5種常見(jiàn)的染色體非整倍體(13、18、21、X和Y染色體)異常及9種微缺失綜合征(Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、Williams-Beuren綜合征、Langer-Giedion綜合征、Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、Miller-Dieker綜合征、Smith-Magenis綜合征及DiGeorge綜合征)，提供了更豐富的信息，提高了產(chǎn)前診斷效率。本文對(duì)1 549份羊水進(jìn)行BoBs快速檢測(cè)，探討其在微缺失/微重復(fù)綜合征檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月至2019年2月在西安市大興醫(yī)院因具有產(chǎn)前診斷指征行羊水穿刺的孕婦1 549例，平均年齡(30.06±5.02)歲，平均孕周(21.90±3.90)周。孕婦的產(chǎn)前診斷指征包括：高齡(≥35歲)；超聲異常；無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)；血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)；不良孕產(chǎn)史；其他(家族遺傳病史、夫妻一方染色體異常等)。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書(shū)，行染色體核型分析及BoBs檢測(cè)，如遇微缺失/微重復(fù)綜合征，樣本增加熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)或染色體微陣列分析(chromosomemicroarray analysis，CMA)檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 羊膜腔穿刺 常規(guī)超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水30 mL，15 mL用于細(xì)胞培養(yǎng)，10 mL用于DNA提取，5 mL用于FISH檢測(cè)。

1.2.2 染色體核型分析 15 mL羊水按照常規(guī)方式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片、G顯帶，每例樣本計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，分析3～5個(gè)核型。發(fā)現(xiàn)染色體異?；蚨鄳B(tài)性變異時(shí)，計(jì)數(shù)50個(gè)分裂相并適當(dāng)增加分析的核型數(shù)。

1.2.3 BoBs檢測(cè) 10 mL羊水2 000 r/min離心10 min，棄上清，利用QIAamp?DNA Blood Mini Kit(德國(guó)Qiagen公司)提取基因組DNA。按照Prenatal BACs-on-BeadsTM試劑盒(美國(guó)Perkin Elmer公司)說(shuō)明書(shū)對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記、純化、與BoBs探針雜交過(guò)夜及報(bào)告分子鏈霉親合素-藻紅蛋白結(jié)合，洗滌后Luminex?200TM讀取信號(hào)強(qiáng)度，BoBsoft?2.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 CMA檢測(cè) 樣本DNA利用Affymetrix公司CytoScan 750K芯片檢測(cè)基因組DNA拷貝數(shù)變化、單親二倍體及雜合性缺失等，Chromosome Analysis Suite(ChAS)軟件進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.2.5 FISH檢測(cè) 5 mL羊水行細(xì)胞處理、玻片處理、變性雜交、洗片、復(fù)染后于熒光顯微鏡下觀察。每例樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)至少50個(gè)細(xì)胞，如果無(wú)法判讀則擴(kuò)大計(jì)數(shù)。FISH探針及試劑盒由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供。

2 結(jié)果

2.1 BoBs技術(shù)對(duì)微缺失/微重復(fù)綜合征的檢出情況 1 549份羊水中BoBs共檢出微缺失/微重復(fù)綜合征8例，檢出率為0.52%。其中Xq27.3缺失綜合征1例，7q11.2重復(fù)綜合征1例，Xp22.31缺失綜合征2例，18p11.32p11.21重復(fù)綜合征1例，8q23.3缺失綜合征1例，4p16.3重復(fù)綜合征1例，22q11.2缺失綜合征1例，見(jiàn)圖1。22q11.2缺失綜合征進(jìn)行FISH驗(yàn)證，其余綜合征CMA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均與BoBs一致。

圖1 BoBs檢測(cè)的微缺失/微重復(fù)綜合征

2.2 染色體核型分析對(duì)微缺失/微重復(fù)綜合征的檢出情況 染色體核型分析只檢出缺失/重復(fù)3例，其中缺失/重復(fù)區(qū)域均在10 Mb左右，見(jiàn)表1。病例1：孕婦因血清學(xué)21三體篩查高風(fēng)險(xiǎn)行羊水穿刺，核型結(jié)果為46，XX，del(X)(q27.3_q28)，BoBs結(jié)果顯示46XX，Xq27.3缺失，CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)Xq27.2q28(140 508 944_155 233 098)區(qū)域出現(xiàn)14.7Mb缺失；病例4：染色體核型分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)記染色體存在，不確定其來(lái)源，BoBs結(jié)果顯示46XX,18p11.32p11.21重復(fù)，CMA驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)18p11.32p11.21(136 285_15 143 614)x4：15Mb，即18號(hào)染色體p11.32p11.21區(qū)域存在15Mb重復(fù)，為18p四體綜合征，其重復(fù)區(qū)域涉及SMCHD1、LPIN2、TGIF1等重要基因，可能導(dǎo)致發(fā)育遲緩、智力障礙、心臟及腎臟異常等嚴(yán)重問(wèn)題；病例6：因21三體風(fēng)險(xiǎn)值1/109于孕19周行羊水穿刺，核型結(jié)果為46，XX，del(8)(q23.1q23.3)，BoBs結(jié)果發(fā)現(xiàn)8q23.3區(qū)域存在缺失，隨后CMA檢測(cè)精確定位發(fā)現(xiàn)8號(hào)染色體q23.1q23.3區(qū)域缺失9.4Mb，該缺失區(qū)域包含TRPS1、EMC2、TRHR、NUDCD1、SYBU等13個(gè)OMIM基因，診斷該胎兒為TRPSⅠ型綜合征，孕婦在染色體核型分析、BoBs和CMA檢測(cè)結(jié)果均異常并進(jìn)行遺傳咨詢后選擇終止妊娠，引產(chǎn)下胎兒可見(jiàn)明顯異常，如毛發(fā)稀疏、梨狀鼻、小下頜、短趾畸形等。

表1 8例微缺失/微重復(fù)綜合征的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前，染色體疾病尚無(wú)有效地治療方法，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，唯一可采取的途徑是盡早進(jìn)行遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷。染色體核型分析是染色體疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其分辨率低，對(duì)5 Mb以下的染色體缺失/重復(fù)很難正確檢出，可能存在一定的漏檢風(fēng)險(xiǎn)。與傳統(tǒng)染色體核型分析相比，BoBs技術(shù)無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)、快速、高通量、準(zhǔn)確性高，除了檢測(cè)5種染色體非整倍體外，還可對(duì)9種常見(jiàn)的微缺失綜合征進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)其覆蓋的探針是已知疾病的關(guān)鍵區(qū)域，結(jié)果明確，易于解讀，提高了產(chǎn)前診斷的效率，降低了遺傳咨詢的難度[4-5]。LI等[6]、HUANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，BoBs技術(shù)除了準(zhǔn)確檢出所有的染色體非整倍體，同時(shí)對(duì)微缺失/微重復(fù)綜合征的檢出能力明顯優(yōu)于染色體核型分析，是一種可選擇的穩(wěn)定準(zhǔn)確的新技術(shù)。

本研究利用BoBs技術(shù)對(duì)1 549份羊水進(jìn)行快速檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)微缺失/微重復(fù)8例，檢出率為0.52%，其中微缺失綜合征5例，微重復(fù)綜合征3例，同時(shí)產(chǎn)前BoBs結(jié)果與FISH、CMA驗(yàn)證結(jié)果完全一致，體現(xiàn)了該技術(shù)在微缺失/微重復(fù)綜合征檢測(cè)方面具有較高準(zhǔn)確性及可靠性。此外，染色體核型分析僅檢出3例，且缺失/重復(fù)區(qū)域均在10 Mb左右，聯(lián)合BoBs技術(shù)擴(kuò)大了0.32%的檢出率，避免了一定的假陰性結(jié)果。本研究中微缺失/微重復(fù)的檢出率較國(guó)內(nèi)外報(bào)道偏低[8-9]，可能與微缺失/微重復(fù)綜合征本身的發(fā)病率較低有關(guān)，其次目前檢測(cè)的樣本量不夠大，可能存在一定范圍的誤差。

近年來(lái)，隨著多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QF-PCR)、FISH、CMA、BoBs等技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的微缺失/微重復(fù)綜合征胎兒被發(fā)現(xiàn)[10-14]。目前臨床上可作為微缺失綜合征預(yù)測(cè)的產(chǎn)前高危因素包括特征性臟器畸形(主要為心臟畸形)；宮內(nèi)發(fā)育遲緩/姿態(tài)異常；羊水過(guò)多/過(guò)少；父母之一有明確微缺失綜合征等。因此，當(dāng)遇到染色體核型分析結(jié)果正常，應(yīng)密切關(guān)注后期超聲結(jié)果，一旦超聲診斷異常，需考慮進(jìn)行下一步檢測(cè)排除微缺失/微重復(fù)等，必要時(shí)盡可能對(duì)胎兒父母樣本進(jìn)行分析，這對(duì)于染色體變異來(lái)源確定具有重要意義[15]。

綜上所述，BoBs技術(shù)是一種敏感、可靠的檢測(cè)技術(shù)，由于覆蓋了更多疾病，對(duì)傳統(tǒng)的染色體核型分析進(jìn)行了很好地補(bǔ)充和完善，在提高染色體異常檢出率的同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間，適合大量樣本的快速處理，值得在臨床中廣泛推廣及應(yīng)用。