王天杰，蘇 丹*，李 雪，普 聿，王 鑫

（1.遼寧大學環(huán)境學院，沈陽 110036；2.沈陽大學區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復教育部重點實驗室，沈陽 110044）

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs），是指由兩個及兩個以上苯環(huán)稠合而成的一類化合物，其所有的碳原子和氫原子都處于同一平面內，是世界上最早發(fā)現(xiàn)的一類化學致癌物[1]。PAHs通過廢水排放、廢物瀝濾、意外排放、大氣沉降等最終進入土壤環(huán)境，并且在土壤中殘留時間長、累積量大，可通過食物鏈進入人體，危害人體健康及生態(tài)環(huán)境[2-4]。微生物修復是土壤PAHs去除的主要且有效途徑[5]，但游離微生物難以適應復雜環(huán)境而不能有效發(fā)揮作用，導致應用結果與試驗結果有較大出入，而微生物固定化技術是解決上述問題的一種有效方法[6-7]。固定化載體的選擇和耐低溫高效PAHs降解菌的篩選是微生物固定化技術修復北方寒冷地區(qū)受PAHs污染的凍融土壤的關鍵[8]。生物質材料不僅對持久性有機污染物吸附能力強，并易通過改性成為良好的吸附材料[9-10]，且可以作為良好的微生物固定化載體，引起了廣泛關注。絲瓜絡是絲瓜成熟種子的維管束，又名絲瓜瓤，是一種天然、低成本、無毒、可生物降解的材料，儲存量巨大，且具有較大的比表面積和孔隙度，使其成為高效的吸附材料及微生物固定化載體[11-12]。

微生物修復中微生物菌體起吸附和降解的雙重作用，由于土壤體系復雜，難以區(qū)分吸附和降解之間的關系[13]，有關微生物修復土壤PAHs的連續(xù)生物吸附和生物降解的研究鮮有報道。而生物吸附和生物降解的共同作用可達到更好地削減有機污染物的效果[14]。宋蕾等[15]考察了活性炭固定化微生物對土壤中1，2，4-TCB的降解效果及活性炭對土壤中1，2，4-TCB的吸附特性，發(fā)現(xiàn)活性炭-微生物系統(tǒng)對土壤中1，2，4-TCB的降解效果優(yōu)于活性炭和游離微生物，活性炭對土壤中1，2，4-TCB的吸附過程比較符合準二級動力學模型。

本文選取課題組分離、培養(yǎng)的假單胞菌（Pseudo?monas sp.SDR4，簡稱S4）、毛霉真菌（Mucormucedo sp.SDR1，簡稱S1）為代表，研究固定化微生物對土壤PAHs的生物吸附以及生物降解的共同作用，探討固定化微生物對土壤PAHs的吸附機理和降解動力學關系，以期為準確了解生物修復過程中PAHs的生物吸附-降解行為提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

微生物載體：絲瓜絡購自中國科學院沈陽生態(tài)站。其元素組成：C含量43.21%，N含量0.91%，H含量8.99%，O含量46.89%。經改性后元素組成：C含量46.53%，N含量1.00%，H含量7.88%，O含量44.58%。

供試土壤：土壤取自中國科學院沈陽生態(tài)試驗站0～20 cm表層清潔土，為草甸棕壤，磨碎，過100目篩備用。其基本理化性狀：pH為6.72，有機碳為17.8 g·kg-1，全氮為 1.1 g·kg-1，全磷為 0.35 g·kg-1，陽離子交換量（CEC）為45.04 mg·kg-1。

1.1.2 試驗藥品

菲（Phe）純度＞95%；芘（Pyr）純度＞98%。均購自百靈威科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH為7.1～7.2，121℃滅菌20 min。

固定化增殖培養(yǎng)基：蔗糖4 g，酵母膏3%，KH2PO40.5 g，（NH4）2HPO42 g，MgSO4·H2O 0.25 g，pH 6.0～6.5，121℃滅菌20 min。

1.1.4 供試菌株

假單胞菌（Pseudomonas sp.SDR4，簡稱S4）、毛霉真菌（Mucormucedo sp.SDR1，簡稱S1）由本課題組分離、培養(yǎng)。篩選自污灌區(qū)受PAHs污染的表層（0～10 cm）凍融土壤，以Phe、Pyr為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選分離得到，并在15℃低溫培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物固定化方法及SEM表征

將條狀絲瓜絡用蒸餾水沖洗以除去灰塵，于65℃烘箱烘干，然后用粉粹機碾磨并過篩（40目），得到絲瓜絡粉末，經高壓高溫（130℃，0.125 MPa）改性5 h，蒸餾水沖洗，120℃下烘箱烘干，得到改性絲瓜絡微生物載體。

將S1和S4分別接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，15℃，110 r·min-1搖床培養(yǎng)30～40 h，制得兩種菌懸液密度為：6×108cfu·g-1。將S1與S4按體積比1∶1接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，相同條件下混合培養(yǎng)3 d，制備復合菌劑。

稱取改性絲瓜絡微生物載體126組，每組40 mg。其中18組做空白對照，108組均用固定化增殖培養(yǎng)基。浸潤12 h，按10%量分別接種S1、S4、S1+S4，放置于低溫光照培養(yǎng)箱（15℃），適量的補充增殖培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結束后用去離子水洗滌固定化微生物數次，便制得固定化微生物。

采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察表面特征。

1.2.2 模擬PAHs生物吸附-降解試驗

取部分以上固定化微生物于高壓蒸汽滅菌器中滅活，作為死體對照。

將土壤分裝于培養(yǎng)瓶中，每瓶4 g，置于高壓蒸汽滅菌器滅菌30 min。將配制好的初始濃度均為120 mg·L-1的Phe、Pyr混合物的丙酮溶液拌入土壤中，配制Phe、Pyr初始含量均為30 mg·kg-1的污染土壤，充分攪拌均勻，放置過夜待丙酮完全揮發(fā)。試驗方法設計如表1所示，試驗設計3組平行。將樣品放置于恒溫培養(yǎng)箱15℃下培養(yǎng)60 d，每10 d取樣檢測，分析其吸附量及降解量。

1.2.3 PAHs的提取

土壤及固定化微生物PAHs濃度提取方法：采用超聲提取，HPLC法測定。提取方式為：經離心，將分離出的土樣、改性絲瓜絡或固定化微生物裝入100 mL玻璃瓶中，加入30 mL丙酮，20 mL二氯甲烷，15 mL 15%的氯化鈉溶液，蓋蓋后超聲波萃取8 h。取出上層液體轉移至硅膠凈化柱中凈化，用50 mL正己烷/二氯甲烷（體積比為9∶1）淋洗，收集濾出液，濃縮至約1 mL，用柔和氮氣吹干，1 mL乙腈定容用HPLC測定PAHs。

1.2.4 PAHs的檢測

PAHs含量用HPLC法測定。色譜條件：色譜柱為多環(huán)芳烴分析專用柱ZORBAXEclipsePAH（4.6 m×250 mm×5μg）；柱溫25℃；流動相為乙腈和水，乙腈∶水＝60%∶40%，流速1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL，各種PAHs以色譜峰保留時間定性，外標法定量（Phe與 Pyr標準溶液均設置為 5、10、20、40、60、80 μg·mL-1），本方法中目標化合物的檢出限為0.1～2.0 ng·L-1，方法回收率79.56%～92.48%。

1.3 數據處理

以下數據均用Oringin 8.0進行擬合分析。

為了更好地分析土壤中Phe與Pyr在樣品上的動力學過程，采用準一級動力學和準二級動力學方程對吸附動力學數據進行擬合，線性表達公式如下：

準一級動力學方程：

式中：k1為準一級吸附速率常數，d-1，k2為準二級吸附速率常數，μg·d-1，Qe表示平衡吸附量，μg；Qt為t時刻吸附量，μg。

2 結果與討論

2.1 改性絲瓜絡及固定化微生物SEM分析

對改性絲瓜絡載體與改性絲瓜絡固定化微生物進行SEM表征，如圖1所示。如圖1（b）所示，絲瓜絡經改性后表面褶皺明顯增多，表面積顯著增大，吸附能力增強，能夠為固定化微生物提供更多的吸附點位，有利于增加固定化微生物的數量，提高降解效率。如圖1（c）所示，絲狀真菌S1生長繁密，縱橫交錯成網狀，有利于增大與污染物的接觸面積，增強吸附及降解能力。如圖1（d）所示，細菌S4附著于絲瓜絡表面及孔隙之中，有利于細菌S4在土壤中的生長繁殖。如圖1（e）所示，細菌S4附著于絲瓜絡表面及孔隙之中的同時，還附著于絲狀真菌S1菌絲表面，隨真菌菌絲移動，可以更大程度地接觸污染物，發(fā)揮細菌-真菌對污染物協(xié)同降解作用。

表1 固定化微生物吸附-降解土壤PAHs試驗處理Table 1 Experimental treatment of soil PAHs by immobilized microorganismadsorption-degradation

2.2 PAHs非生物損失量

對CK中Phe與Pyr的檢測，結果表明PAHs在滅菌土壤中不易自然揮發(fā)與光解。在本試驗條件下，60 d后CK樣品中Phe與Pyr仍分別含有88.56%、92.55%。表明揮發(fā)損失與自然降解所造成的污染物非生物損失很小。所以在本試驗條件下，試驗組土壤Phe與Pyr含量的減少，應該是固定化微生物吸附降解的結果。以下數據處理均不計自然揮發(fā)等非生物損失量，將其排除在外。

2.3 死體固定化微生物對PAHs的吸附量及動力學

2.3.1 死體固定化微生物對PAHs的吸附量

圖1 固定化微生物SEM圖Figure 1 SEMimage of immobilized microorganisms

死體固定化微生物對PAHs的吸附量，如圖2所示。4組樣品對Phe與Pyr的吸附量曲線趨向一致，在前10 d吸附速率最快，CK、S1-D、S4-D、S1+S4-D對Phe的吸附速度分別為0.37、0.45、0.37、0.49 μg·d-1；對 Pyr的吸附速度分別為 0.26、0.28、0.27、0.30 μg·d-1。隨時間的遷移，吸附速率逐漸降低。60 d后達到動態(tài)吸附平衡，CK、S1-D、S4-D、S1+S4-D對Phe的動態(tài)平衡吸附量分別為5.28、6.82、5.73、7.46 μg；對Pyr的動態(tài)平衡吸附量分別為4.17、4.72、4.53、5.00 μg；固定化微生物整體吸附劑對Phe與Pyr的吸附量高于未固定化微生物載體。

本試驗中，死體固定化微生物對土壤PAHs的吸附過程是PAHs橫向遷移的過程，而吸附是控制土壤PAHs遷移的主要機制[16]，故將此過程以吸附的理論解釋。S1-D、S4-D、S1+S4-D對Phe與Pyr的吸附量較CK大，表明固定化微生物能增大整體比表面積，增強吸附能力。S1+S4-D對Phe與Pyr的吸附量高于S1-D、S4-D，表明固定化混合菌吸附能力強于固定化單菌。S1-D對Phe與Pyr的吸附量高于S4-D，這可能是由于絲狀真菌細胞壁中含有幾丁質和纖維素的纖維狀結構，有利于有機分子在其表面富集。

從整體吸附過程看，4種樣品對Phe與Pyr的吸附過程均可以分為快速吸附（1～10 d）-緩慢吸附（10～40 d）-平衡吸附（40～60 d）3個階段。早有研究證明，絲瓜絡對有機污染物的吸附作用以單分子層吸附為主[17-18]，微生物死體對非極性有機污染物的吸附機制為分配作用[19]；而本文8條吸附曲線都是單一和連續(xù)的，表明Phe與Pyr在吸附劑表面可看作單分子層吸附[20]。這可能是由于固定化載體的吸附量遠大于死體微生物的吸附量，從而使死體微生物的吸附特征無法影響固定化載體的吸附特征。

2.3.2 死體固定化微生物對PAHs的吸附動力學

為了更好地分析土壤中Phe與Pyr在4種樣品上的動力學過程，分別采用描述外部傳質過程的準一級動力學（1）和主要描述化學吸附過程的準二級動力學方程（2）對吸附動力學數據進行擬合，擬合結果如圖3、圖4所示，擬合參數見表2。

準二級動力學模型擬合結果R2均大于0.99，較準一級動力學模型擬合效果好，且準二級動力學模型擬合平衡吸附量Qe較準一級動力學模型更接近于實際試驗值，說明4種樣品對土壤中Phe與Pyr的吸附過程服從于準二級動力學模型。

如圖3、圖4所示。準一級動力學模型僅適合描述4種樣品對土壤中Phe與Pyr的吸附過程中快速吸附和平衡吸附階段。而對于中間的緩慢吸附過程，則不適合用準一級動力學模型來描述，說明外部傳質對吸附過程具有控制作用[21]。Phe與Pyr從土壤向各個樣品組分的遷移過程中，經歷了解吸、水膜擴散、吸附劑顆粒表面擴散和吸附劑內部微孔擴散等多個過程，因此準二級動力學模型更好地描述了死體固定化微生物對PAHs的吸附動力學過程。準二級動力學模型是基于化學吸附的假設，化學吸附涉及到吸附劑與吸附質之間存在電子共用或電子轉移[22-23]，因此可以判斷化學作用是控制吸附速率的主要因素。

圖2 死體固定化微生物對PAHs的吸附量Figure 2 Adsorption of PAHs by lethal immobilized microorganisms

2.4 活體固定化微生物對PAHs的吸附量及動力學

2.4.1 活體固定化微生物對PAHs的吸附量

活體固定化微生物對PAHs的吸附量如圖5所示。4種樣品對土壤中Phe與Pyr的吸附速率緩慢，吸附量隨時間變化曲線基本呈直線。60 d后，S1、S4、S1+S4對Phe的動態(tài)吸附量分別為2.32、2.01、2.76μg；S1、S4、S1+S4對Pyr的動態(tài)吸附量分別為 2.79、2.41、3.14 μg。

由于微生物的降解作用會阻礙Phe與Pyr在土壤中的遷移[24-25]，故與死體固定化微生物對Phe與Pyr的吸附量相比，活體固定化微生物對Phe與Pyr的吸附量大幅下降。另外微生物能降解自身吸附的PAHs[26]，隨著土壤體系中Phe與Pyr含量的減少，吸附在微生物菌體上的Phe與Pyr也將被降解。

圖3 死體固定化微生物對Phe的吸附動力學Figure 3 Adsorption kinetics of Phe by lethal immobilized microorganisms

圖4 死體固定化微生物對Pyr的吸附動力學Figure 4 Adsorption kinetics of Pyr by lethal immobilized microorganisms

表2 死體固定化微生物吸附動力學擬合參數Table 2 Fitting parameters of adsorption kinetics by lethal immobilized microorganisms

圖5 活體固定化微生物對PAHs的吸附量Figure 5 Adsorption of PAHs by living immobilized microorganisms

2.4.2 活體固定化微生物對PAHs的吸附動力學

為了更好地分析土壤中Phe與Pyr在4種樣品上的動力學過程，分別采用公式（1）和公式（2）對吸附動力學數據進行擬合，擬合參數見表3。

如表3所示，由于微生物的降解作用，與死體固定化微生物相比，活體固定化微生物對土壤中Phe與Pyr的準一級吸附動力學與準二級動力學擬合結果R2相差較小，沒有明顯地服從于準一級動力學或準二級動力學?；铙w固定化微生物對土壤中Phe的準一級吸附動力學擬合結果R2大于準二級吸附動力學，趨向于服從準一級動力學模型；活體固定化微生物對土壤中Pyr的準一級動力學擬合結果R2小于準二級動力學，趨向于服從準二級動力學模型。這可能是由于S1、S4、S1+S4對 Phe的降解能力高于 Pyr（見本文2.5.1）。由此可見，微生物的降解能力越強，對阻礙PAHs在土壤中遷移的影響越大。劉凌等[27]通過對“Alcoa公司采用土地生物處理的方法來處理土壤中的PAHs”建立數學模型發(fā)現(xiàn)，在微生物高降解率作用下，有機污染物在外部水相中生物降解的速度遠比其解吸、擴散的速度快。也就是說，在其他條件一致時，當降解效率高到一個臨界點時，將使得微生物對PAHs的降解效率高于PAHs在土壤中的遷移效率。

2.5 微生物對PAHs的降解能力及動力學

2.5.1 微生物對PAHs的降解能力

差減法計算微生物對PAHs的降解率，即降解率=（總量-自然損失-活體固定化微生物對PAHs的吸附量-土壤中剩余量）/總量×100%，結果如圖6所示。試驗進行60 d后，3組樣品對Phe與Pyr均有不同程度的降解，S1、S4、S1+S4對 Phe的降解率分別為54.34%、61.45%、64.23%，對 Pyr的降解率分別為38.42%、35.02%、42.43%。3組樣品中，Phe的降解速率隨時間變化趨勢一致，0～20 d為降解初期，20 d時S1、S4、S1+S4對 Phe的降解率分別達到 32.32%、40.42%、46.67%；20～50 d降解速率有所降低，為降解中期；50 d后，降解緩慢，Phe的含量下降不明顯，為降解后期。3組樣品中，Pyr的降解速率隨時間變化趨勢也一致，0～10 d為降解前期，10 d時S1、S4、S1+S4對Pyr的降解率分別達到18.38%、15.32%、21.24%；10～50 d為降解中期，50 d后，降解緩慢，Pyr的含量下降不明顯，為降解后期。固定化混合菌對Phe與Pyr的降解率高于固定化單菌。

固定化微生物對PAHs的降解能力優(yōu)于游離菌[8]，絲瓜絡具備橫截面的格子框架及其高孔隙率，是一種高潛力的細胞固定化載體[28]。同時，絲瓜絡作為載體具有強大的吸附能力，對微生物及PAHs降解酶有很強的吸附力，高孔隙度能保證吸附固定大量微生物，為菌體創(chuàng)造良好的生活環(huán)境，避免菌體與惡劣土壤環(huán)境的直接接觸[29]。

研究結果表明，S4對Phe的降解能力強于S1，而S4對Pyr的降解能力弱于S1。S1+S4對Phe與Pyr的降解率均高于S1、S4，表明S1、S4在降解Phe與Pyr的過程中起到協(xié)同作用。陳凱等[30]認為絲狀真菌與細菌混合后降解原油，微生物數量顯著增加，且降解效率明顯提高，說明混合菌中真菌與細菌存在協(xié)同作用。3組樣品對Phe的降解率明顯高于Pyr，這是由于微生物降解過程中主要利用土壤中游離的PAHs，而Pyr的環(huán)數多于Phe，其正辛醇-水分配系數大于Phe，更易吸附在土壤有機質中，不易解吸，導致Pyr從土壤向游離水中的遷移率低[31]，無法被微生物更有效地利用，因此Phe的降解率高于Pyr。

整個試驗過程中，3種樣品對Phe與Pyr的降解速度都呈現(xiàn)出先快后慢的趨勢，是由于各個階段的降解機制不同造成的。在降解初期，PAHs濃度較高，此時微生物對PAHs的降解作用伴隨著一系列的物理、化學變化，在多種作用的協(xié)調下，降解速率快。降解中期，PAHs的降解速率減緩的原因可能有：（1）微生物降解作用占據主要地位，物理化學作用降低，使總作用強度降低[32]；（2）微生物降解過程中產生的中間產物還未完全被降解，與未降解的PAHs產生競爭作用。降解后期，降解速率緩慢，PAHs含量下降不明顯，可能因為：（1）PAHs長時間殘留于土壤中，一部分被土壤有機質不可逆屏蔽，另一部分可逆吸附于土壤固定相的PAHs解吸速率緩慢[27]，導致降解速率緩慢；（2）PAHs擴散轉運速率遠低于微生物對其降解速率，導致微生物缺乏營養(yǎng)供應，生長不良[33]。

表3 活體固定化微生物吸附動力學擬合參數Table 3 Fitting parameters of adsorption kinetics by living immobilized microorganisms

圖6 微生物對PAHs的降解率Figure 6 Degradation rate of PAHs by microorganisms

2.5.2 微生物對PAHs的降解動力學

建立Monod模型，推導后得到動力學方程式：

式中：c為多環(huán)芳烴濃度，mg·kg-1；t為反應時間，d；K為動力學常數。Phe與Pyr的降解反應符合一級動力學特征，擬合參數見表4。

由表4可見，Phe經S1、S4、S1+S4處理后的降解半衰期分別為38.88、29.41、25.63 d，其中S1+S4最短。Pyr經S1、S4、S1+S4處理后的降解半衰期分別為64.76、69.02、59.28 d，其中S1+S4最短。說明經絲瓜絡固定化混合菌較固定化單菌降解效率高，極大提高Phe與Pyr的降解速度，半衰期變短。

3 結論

（1）固定化微生物能增大載體的吸附量，固定化真菌吸附能力大于固定化細菌，固定化混合菌吸附能力大于固定化單菌。固定化微生物吸附曲線是單一和連續(xù)的，表明Phe與Pyr在吸附劑表面可看作單分子層吸附。

（2）絲瓜絡固定化載體及死體固定化微生物S1-D、S4-D、S1+S4-D對土壤中Phe與Pyr的吸附過程服從于準二級動力學模型。外部傳質對死體固定化微生物吸附PAHs過程具有控制作用，且化學作用是控制此吸附過程吸附速率的主要因素。

（3）微生物的降解作用會阻礙Phe與Pyr在土壤中的遷移，且提高微生物的降解能力，能增加對土壤中PAHs遷移的影響；在其他條件一致時，當降解效率高到一個臨界點時，將使得微生物對PAHs的降解效率高于PAHs在土壤中的遷移效率。

（4）試驗60 d，S1、S4、S1+S4對Phe的降解率分別為54.34%、61.45%、64.23%，對Pyr的降解率分別為38.42%、35.02%、42.43%。混合菌中真菌與細菌存在協(xié)同作用，因而固定化混合菌降解能力大于固定化單菌。Monod模型可以清晰地分析固定化微生物對土壤PAHs降解的動力學過程。通過Monod模型證實，土壤中Phe與Pyr經S1+S4處理后的降解半衰期最短，分別為25.63、59.28 d。

表4 微生物對PAHs的降解動力學方程及參數Table 4 Kinetic equations and parameters of degradation of PAHsby microorganisms