唐偉欣，孫興濱，高浩澤，程首濤，仇天雷*，王旭明

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097）

為了滿足消費(fèi)者對(duì)禽畜產(chǎn)品日益增長(zhǎng)的需求，我國(guó)的養(yǎng)殖模式已從散戶養(yǎng)殖轉(zhuǎn)向規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖。伴隨著集約化禽畜養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，抗生素作為疾病預(yù)防和治療藥物、生長(zhǎng)促進(jìn)劑廣泛應(yīng)用于集約化畜禽養(yǎng)殖[1]。我國(guó)每年抗生素原料生產(chǎn)量約21萬t，其中有近一半的抗生素應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[2]。而這些用于畜禽養(yǎng)殖的抗生素大多數(shù)不能被動(dòng)物完全吸收，約有60%～90%的抗生素以原藥或初級(jí)代謝產(chǎn)物的形式排放到環(huán)境中，導(dǎo)致抗生素殘留，并引起環(huán)境中耐藥菌和耐藥基因的富集擴(kuò)散[3-4]，如不經(jīng)有效的無害化處理，會(huì)給公共健康帶來嚴(yán)重威脅[5-6]。眾多研究證實(shí)，畜禽糞便已經(jīng)成為了自然環(huán)境中耐藥細(xì)菌和耐藥基因的“儲(chǔ)存庫(kù)”[7]。多重耐藥菌是指對(duì)臨床使用的3類或3類以上抗菌藥物同時(shí)呈現(xiàn)耐藥的細(xì)菌，牛天琦[8]利用卡那霉素等8種抗生素平板從雞糞中分離并鑒定了多株多重耐藥菌，集中分布于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門中。張昊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在含有四環(huán)素、環(huán)丙沙星及慶大霉素的平板上，從豬糞、雞糞中分離出的多重耐藥菌主要為埃希氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、變形桿菌屬、依格納季氏菌屬和費(fèi)克藍(lán)姆菌屬。Yang等[10]在雞糞樣品中檢測(cè)到包括大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenesfaecalis）和腸球菌（Enterococcus spp）在內(nèi)的多種抗生素耐藥的致病菌。但以上研究多集中于養(yǎng)殖糞便中抗生素耐藥微生物的分離及鑒定，對(duì)豬、牛、雞等不同養(yǎng)殖來源糞便以及有機(jī)肥中多耐藥細(xì)菌特征的對(duì)比研究并不多見。

由于四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和磺胺類抗生素是我國(guó)畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖常用的抗生素[11]，這四類抗生素多重耐藥菌的存在會(huì)對(duì)畜禽養(yǎng)殖造成危害，如果糞污處理不當(dāng)會(huì)造成一定的環(huán)境及健康風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究從我國(guó)北方地區(qū)的典型集約化養(yǎng)殖場(chǎng)采集了肉雞、蛋雞、肉牛、奶牛、生豬5種不同禽畜糞便，以及糞源有機(jī)肥樣品。首先，通過對(duì)四環(huán)素、恩諾沙星、磺胺甲惡唑和泰樂菌素4類抗生素的多重耐藥菌計(jì)數(shù)，了解不同養(yǎng)殖糞污中多重耐藥菌的污染狀況及堆肥前后多重耐藥菌的數(shù)量變化特征；其次，通過對(duì)多重耐藥菌的分離、純化及16SrDNA基因全長(zhǎng)對(duì)比，確定所獲得的耐藥菌株的分類地位；通過藥敏試驗(yàn)，探討不同養(yǎng)殖糞便來源的多重耐藥細(xì)菌對(duì)不同抗生素的耐藥分布情況；最后，通過擴(kuò)增整合子基因盒，總結(jié)畜禽糞便中多重耐藥菌的可移動(dòng)元件特征。本研究為了解禽畜糞便中常見的多耐藥微生物種類及其耐藥特征，以及養(yǎng)殖糞污處理對(duì)耐藥微生物的有效控制等方面均提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源、采集及含水率測(cè)定

本次試驗(yàn)所需用的畜禽糞便采取5點(diǎn)混合取樣的方法，共采集16個(gè)樣品，分別是雞糞樣品5種（蛋雞2種，肉雞3種）、牛糞樣品4種（奶牛2種，肉牛2種）、豬糞3種、雞糞有機(jī)肥2種、豬糞有機(jī)肥2種，每種樣品各20 g。雞糞及豬糞有機(jī)肥樣品均采自養(yǎng)殖小區(qū)的堆肥設(shè)施，采樣季節(jié)堆肥輔料以秸稈為主。采集糞便樣品后，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室于4℃保藏，在24 h內(nèi)進(jìn)行耐藥菌的計(jì)數(shù)和含水率測(cè)定。

1.2 培養(yǎng)基的配制

將溶化的LB固體培養(yǎng)基降溫至50℃左右后，加入4種抗生素后倒平板?？股氐淖罱K濃度為：四環(huán)素16 μL·mL-1，恩諾沙星1 μL·mL-1，磺胺甲惡唑76μL·mL-1，泰樂菌素1 μL·mL-1。同時(shí)設(shè)置不加抗生素的LB培養(yǎng)基平板，進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定。

1.3 多重耐藥菌的計(jì)數(shù)、分離及篩選

稱取10 g糞便或有機(jī)肥樣品，倒入裝有已滅好菌的90 mL生理鹽水的三角瓶中，制成均勻的懸液。按10倍法進(jìn)行系列稀釋，稀釋到10-6。土壤懸液涂布接種：空白板選取 10-3、10-4、10-53個(gè)稀釋度，添加抗生素板選取10-2、10-3、10-43個(gè)稀釋度。待土壤懸液吸收后將平板倒置于28℃恒溫箱中，培養(yǎng)48 h。取出平板，選取菌落數(shù)在20～200的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)隨機(jī)挑選5個(gè)單菌落，接種新平板并培養(yǎng)48 h。隨后多次劃線純化后，將獲得的菌液與30%甘油等體積比混合后，保藏于-80℃冰箱中待用。

1.4 多重耐藥菌的分子鑒定

采用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取菌株DNA，PCR擴(kuò)增16SrDNA基因，引物為：27F、1492R。PCR反應(yīng)體系為：PCR mix為12.5μL，forward primer及reverse primer均為1μL，ddH2O為9.5μL，template DNA為1μL，共 25μL。PCR反應(yīng)條件：初始變性98℃，3 min循環(huán)1次；變性98℃，10 s循環(huán)30次；退火55℃，10 s循環(huán)30次；延伸72℃，10 s循環(huán)30次；最終延伸72℃，3 min循環(huán)1次；4℃保持。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物送到北京博邁德基因技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 多重耐藥菌的耐藥性試驗(yàn)

1.5.1 藥敏紙片

本次試驗(yàn)采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B）檢測(cè)細(xì)菌耐藥性，所用的抗生素紙片有頭孢噻呋、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素、諾氟沙星、氨芐西林、恩諾沙星、紅霉素、氯霉素、磺胺甲惡唑、左氧氟沙星、阿米卡星、四環(huán)素、頭孢哌哃。

1.5.2 涂布法測(cè)定細(xì)菌耐藥性

采用紙片法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，具體試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.6 耐藥菌整合子擴(kuò)增

1.6.1 Ⅰ、Ⅱ類整合子的擴(kuò)增

對(duì)已有的85株菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增Ⅰ、Ⅱ類整合子基因，引物為：intlF、intlR；int2F、int2R。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[13]。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增出的DNA進(jìn)行電泳，有電泳條帶的則表示含有Ⅰ、Ⅱ類整合子基因。

1.6.2 Ⅰ、Ⅱ類整合子基因盒的擴(kuò)增

對(duì)上述有電泳條帶的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增Ⅰ、Ⅱ類整合子基因盒，引物為：intl-VF、intl-VR；int2-VF、int2-VR。PCR反應(yīng)體系為：PCR mix為20μL，引物為0.8μL，ddH2O為16.4μL，template DNA為2μL，共40μL。PCR反應(yīng)條件同上。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物送到北京博邁德基因技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Origin 8.5進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理和作圖；采用R語言LSD方法對(duì)不同種類樣品的計(jì)數(shù)結(jié)果是否存在顯著差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；利用MEGA-X軟件進(jìn)行16SrDNA序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中多重耐藥菌概況

本文選擇四環(huán)素、恩諾沙星、磺胺甲惡唑和泰樂菌素作為典型抗生素，對(duì)17個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)糞便及有機(jī)肥樣品進(jìn)行多重耐藥培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，所有糞樣品中，雞糞中多重耐藥菌絕對(duì)數(shù)量較高，范圍在8.23×106～8.61×107cfu·g-1；豬糞其次，范圍在 2.83×104～3.70×106cfu·g-1；牛糞最少，范圍在2.53×105～1.70×106cfu·g-1。而有機(jī)肥樣品中耐藥菌的絕對(duì)數(shù)量有明顯下降，其范圍在5.30×103～1.23×106cfu·g-1之間。

如表1所示，在糞樣品中，雞糞中耐藥菌平均絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)數(shù)量均最高，耐藥菌的平均數(shù)量是4.26×107cfu·g-1，平均占比為29.14%；其次為豬糞，耐藥菌的平均數(shù)量是3.95×106cfu·g-1，平均占比為9.13%；而牛糞中耐藥菌的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)數(shù)量均最低，耐藥菌的平均數(shù)量是1.17×106cfu·g-1，平均占比為0.79%。與Yang等[10]研究結(jié)果類似，雖然生豬養(yǎng)殖過程中抗生素使用濃度和糞便中抗生素殘留均高于肉雞養(yǎng)殖，但雞糞中多重耐藥菌的比例都遠(yuǎn)高于豬糞，這說明抗生素殘留濃度并不是多重耐藥菌多少的唯一決定因素，還與養(yǎng)殖動(dòng)物腸道微生物組成相關(guān)。而養(yǎng)牛場(chǎng)中抗生素使用頻率和濃度均最低，這與牛糞中多重耐藥菌濃度較低的規(guī)律保持一致。統(tǒng)計(jì)分析表明，雞糞中多重耐藥菌數(shù)顯著高于其他糞源（P＜0.01）。

表1 養(yǎng)殖場(chǎng)糞污與有機(jī)肥中可培養(yǎng)多耐藥細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Counting results of culturable multi-drug resistant bacteria in farmmanure and organic fertilizer

在有機(jī)肥中，雞糞有機(jī)肥耐藥菌平均相對(duì)豐度最低，耐藥菌的平均數(shù)量是7.45×103cfu·g-1，平均占比為0.43%；而豬糞有機(jī)肥耐藥菌平均相對(duì)豐度最高，耐藥菌的平均數(shù)量是3.69×105cfu·g-1，平均占比為3.17%。雞糞有機(jī)肥中耐藥菌的絕對(duì)數(shù)量與雞糞相比下降了4個(gè)數(shù)量級(jí)，平均相對(duì)數(shù)量也同時(shí)降低，從29.14%下降到3.17%；豬糞有機(jī)肥中雖然平均絕對(duì)數(shù)量變化不大，但由于堆肥能夠減少總的微生物數(shù)量，使得多重耐藥微生物的相對(duì)數(shù)量有所下降，從9.13%下降到0.43%。統(tǒng)計(jì)分析表明，雞糞和豬糞中多重耐藥菌的比例顯著高于牛糞和有機(jī)肥，說明對(duì)雞糞和豬糞進(jìn)行好氧堆肥能夠有效降低其中的多重耐藥菌的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)數(shù)量，而牛糞中多重耐藥菌數(shù)量相對(duì)較少。

2.2 養(yǎng)殖糞污中多重耐藥菌多樣性分析

通過多重耐藥培養(yǎng)基篩選、分離和純化，總共分離出75株多重耐藥菌，其中來自于雞糞源的有23株，豬糞源的有11株，牛糞源的有18株，有機(jī)肥來源的23株。經(jīng)16SrDNA序列全長(zhǎng)測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖2），75株菌共有32個(gè)種（Species）分布于17個(gè)屬、11個(gè)科、3個(gè)門中（表2）。

圖1 養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中多重耐藥菌系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Multi-drug resistant phylogenetic tree in farmmanure

表2 多重耐藥菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Table 2 Phylogenetic relationships of multi-drug resistant bacteria

經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹圖分析表明，在門水平，禽畜養(yǎng)殖糞便中多重耐藥菌集中分布Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria，這與王曉慧[14]研究的結(jié)果較為一致。其主要分布在Proteobacteria，有41株，包括雞糞源13株、牛糞源16株、豬糞源6株、雞糞有機(jī)肥源3株和豬糞有機(jī)肥源3株；其次是Firmicutes，有18株，包括雞糞源7株、雞糞有機(jī)肥源5株和豬糞有機(jī)肥源6株；在Actinobacteria中也有16株分布，包括雞糞源3株、牛糞源2株、豬糞源5株和雞糞有機(jī)肥源6株。在屬水平中，Escherichia中分離到的耐藥菌株數(shù)量最高，為13株，占總耐藥菌株數(shù)量的17.33%，該屬細(xì)菌在雞糞、豬糞、牛糞和有機(jī)肥中均有分離。Escherichia是動(dòng)物糞便中常見的耐藥菌屬[15-16]，其分離源主要有豬糞、雞糞等[17]，我們應(yīng)更加重視其在環(huán)境中的傳播風(fēng)險(xiǎn)。其次為Corynebacterium，占總耐藥菌株數(shù)量的14.67%，已有研究表明棒狀桿菌能夠引起嚴(yán)重的呼吸道感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎等[18-19]。再次為Staphylococcus，占總耐藥菌株數(shù)量的9.33%，葡萄球菌也是重要的人畜共患致病菌，近年來MRSA[20-22]由于其超強(qiáng)的耐藥性而受到臨床和環(huán)境研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，雖然本研究中并未發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌，但有兩個(gè)近源屬被分離，且都分離自有機(jī)肥，說明堆肥對(duì)葡萄菌屬耐藥菌的控制作用有限。最后為Kurthia，占總耐藥菌株數(shù)量的8%，目前，并未發(fā)現(xiàn)特庫(kù)氏菌為病原菌的明確記載，其廣泛分布于環(huán)境中，尤其是動(dòng)物糞便中[23]。

通過對(duì)比不同養(yǎng)殖用途畜禽糞便中多重耐藥菌的數(shù)量及種類可知，在23株雞糞分離源的菌株中，有8株菌來自于蛋雞源，15株菌來自于肉雞源。蛋雞源中分離出的變形桿菌屬菌株最多，有3株，占37.5%；而在肉雞源中，分離出的庫(kù)特氏菌屬最多，有6株，占40%。其次是志賀氏菌屬，有5株，占33.33%。在18株牛糞分離源的菌株中，來自于奶牛源和肉牛源的株菌各為9株。奶牛源的菌株中，嗜冷桿菌屬比例最多，有4株，占44.44%，其次是埃希氏菌屬，有3株，占33.33%。肉牛源的9株菌中，分離出的埃希氏菌屬菌株最多，有5株，占55.56%。

在所有耐藥菌株中，僅在雞糞中分離出的菌有：Ignatzschineria cameli、Proteus mirabilis、Proteus penne?ri、Kurthia gibsonii、Lysinibacillus jejuensis、Glutamici?bacter halophytocola，其中Ignatzschineria是雞糞中主要的多重耐藥菌屬之一，并且其菌體內(nèi)攜帶有能夠整合多重耐藥基因的整合子結(jié)構(gòu)[10]。Proteusmirabilis是一種腐生性的條件致病菌，其自身的多重耐藥性可能與養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素使用不規(guī)范有關(guān)[24-25]。Kim等[26]在豬糞中分離出Lysinibacillusjejuensis，本研究表明其分離源并不僅限于豬糞中。僅在牛糞中分離出的菌有KE701379_s、Psychrobacter faecalis、Psychrobacter pul?monis、Providencia alcalifaciens、Oblitimonas alkaliphi?la、Corynebacterium casei、Corynebacterium freneyi，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）主要存在于魚類、家禽及肉制品中[27]，目前并未發(fā)現(xiàn)它的致病性。由于長(zhǎng)期濫用廣譜抗生素，造成普羅威登斯菌屬（Providencia）對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等11類的13種常用藥物高度耐藥[28]，此外王建昌等[29]也在一進(jìn)口美國(guó)種豬新鮮糞便樣品中分離到一株blaNDM-1基因陰性的雷氏普羅威登斯菌；僅在豬糞中分離出的菌有Psy?chrobacter maritimus、Corynebacterium stationis，棒桿菌屬（Corynebacterium）的部分細(xì)菌是一類生豬鼻腔內(nèi)常攜帶的病原菌，目前有研究表明，其有可能通過空氣傳播給人類[30]。有機(jī)肥中耐藥菌與養(yǎng)殖糞便中有所不同，其主要分布在不動(dòng)桿菌、假單胞菌、氣球菌和葡萄球菌屬內(nèi)，而在畜禽糞便耐藥菌中占優(yōu)勢(shì)的腸桿菌和棒狀桿菌并不占據(jù)優(yōu)勢(shì)，可能原因是腸桿菌和棒狀桿菌的耐熱性不好，在堆肥的高溫過程中多被有效殺滅，曾維揚(yáng)[31]的研究中指出在60℃水浴處理0.5 min后，腸桿菌的死亡率高達(dá)99.9%。王曉慧[14]也指出棒狀桿菌在經(jīng)過高溫堆肥后也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而革蘭氏陽性菌的Aerococcus和Staphylococcus相對(duì)有更好的耐熱性，因此在有機(jī)肥中更易于存活。續(xù)彥龍等[32]研究指出在堆肥第0 d，樣品中金黃色葡萄球菌濃度均達(dá)到108cfu·g-1，堆肥第7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組樣品中金黃色葡萄球菌即使降低至103cfu·g-1，但仍有較好存活。此外，Aerococcus和Staphylococcus同屬于厚壁菌門，許修宏等[33]指出，在堆肥中其相對(duì)豐度整體呈先升后降趨勢(shì)，在升溫期和高溫期相對(duì)豐度最高表明其耐熱性較好。

2.3 分離菌株的耐藥性特征

對(duì)23株雞糞多重耐藥菌樣品、18株牛糞多重耐藥菌樣品、11株豬糞多重耐藥菌樣品進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其抗生素耐藥檢測(cè)結(jié)果見表3～表5。

在雞糞中分離出的23株多重耐藥菌中，對(duì)15種抗生素的耐藥性由弱至強(qiáng)依次為：阿米卡星＜頭孢噻呋＜慶大霉素=左氧氟沙星＜頭孢哌哃＜氨芐西林＜青霉素=諾氟沙星＜四環(huán)素＜磺胺甲惡唑＜環(huán)丙沙星=恩諾沙星＜氯霉素=氟苯尼考＜紅霉素；而在牛糞中分離出的18株多重耐藥菌中，耐藥性由弱至強(qiáng)依次為：阿米卡星＜慶大霉素＜頭孢噻呋＜左氧氟沙星=環(huán)丙沙星=頭孢哌哃＜恩諾沙星＜氟苯尼考＜氯霉素＜諾氟沙星＜氨芐西林＜四環(huán)素=青霉素＜磺胺甲惡唑=紅霉素。在豬糞中分離的11株多重耐藥菌的耐藥性由弱至強(qiáng)依次為：阿米卡星＜頭孢噻呋=頭孢哌哃＜恩諾沙星＜青霉素=慶大霉素=氨芐西林=諾氟沙星＜左氧氟沙星＜環(huán)丙沙星＜氟苯尼考=氯霉素=磺胺甲惡唑＜四環(huán)素＜紅霉素。其中，3種分離源的菌株對(duì)紅霉素和四環(huán)素的耐藥性均高于70%，這可能與養(yǎng)殖過程中長(zhǎng)期使用大環(huán)內(nèi)脂類和四環(huán)素類抗生素作為飼料添加劑有關(guān)，Pan等[34]檢測(cè)表明豬糞中四環(huán)素類抗生素殘留量達(dá)到764.4 mg·kg-1。除此以外，雞糞分離源菌株中檢測(cè)到耐藥率超過70%的抗生素有5種，為磺胺甲惡唑、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素及氟苯尼考。在牛糞分離源菌株中檢測(cè)到耐藥率超過70%的抗生素也有5種，為氯霉素、諾氟沙星、氨芐西林、青霉素及磺胺甲惡唑，它們常用于治療和預(yù)防疾病，Zhao等[35]對(duì)我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便調(diào)查發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星、恩諾沙星在牛糞中含量分別為29.59 mg·kg-1和46.70 mg·kg-1。

蛋雞和肉雞分離源菌株耐藥性對(duì)比結(jié)果表明，在8株蛋雞分離源的菌株中，其對(duì)氟苯尼考、磺胺甲惡唑、紅霉素的耐藥率均達(dá)100%；而對(duì)頭孢哌哃及阿米卡星的耐藥率低于30%。與肉雞分離源的8株菌對(duì)比，除紅霉素耐藥率相同外，氯霉素和恩諾沙星的耐藥率也為100%；敏感率較高的是阿米卡星和頭孢噻呋。奶牛和肉牛分離源菌株耐藥性對(duì)比結(jié)果表明，兩者對(duì)磺胺甲惡唑和紅霉素的耐藥率均達(dá)到100%。在奶牛的分離源株菌中，其對(duì)頭孢稀類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素耐藥率均低于50%，而耐藥率低于50%的肉牛分離源菌株中只有氨基糖苷類中的阿米卡星。

3類動(dòng)物糞污中的多重耐藥菌均對(duì)養(yǎng)殖中常用的抗生素如氯霉素類、氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類等抗生素有著較高的耐藥性，而對(duì)氨基糖苷類和頭孢稀類抗生素都有著較高的敏感率，尤其是對(duì)阿米卡星這種抗生素，豬糞中的多抗菌對(duì)其耐藥率為0，而在雞糞和牛糞中多抗菌的耐藥率也分別僅為13.04%和27.78%。楊永珍等[12]的研究也表明，在河南部分地區(qū)大多數(shù)雞志賀氏菌對(duì)氨芐/舒巴坦和阿米卡星較為敏感。佟盼盼[36]對(duì)來自東北和江蘇地區(qū)雞糞樣品中的大腸桿菌進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)指出，其對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氯霉素、左氧氟沙星、慶大霉素耐藥率在50%以上，而對(duì)阿米卡星為敏感。對(duì)新疆耆縣規(guī)?；i場(chǎng)大腸桿菌藥敏試驗(yàn)顯示，對(duì)氨芐西林、氟苯尼考、慶大霉素、諾氟沙星及恩諾沙星這五種藥物耐藥率在26.5%～66.3%[37]，采集于武漢郊區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的樣品中分離的大腸桿菌對(duì)于頭孢噻呋、頭孢哌哃及阿米卡星的高敏率均在80%以上[38]。這表明不同地區(qū)多重耐藥菌的耐藥性都是類似的，與本研究相符。龐歌[39]在2010年研究顯示，針對(duì)河南區(qū)域雞源志賀氏菌的藥敏試驗(yàn)，其對(duì)磺胺類及氟喹諾酮類抗生素耐藥性較高，而對(duì)氨基糖苷類抗生素較為敏感。由此可知，近些年來β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性有所提高。畜禽養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病的復(fù)雜性增加了抗菌藥物在臨床上的預(yù)防及治療用量，這使得來自于糞便的細(xì)菌也產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性。本研究也為日后養(yǎng)殖糞污處理過程中抗生素耐藥細(xì)菌的去除規(guī)律研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也使進(jìn)一步改進(jìn)糞污處理工藝的相關(guān)研究更易聚焦關(guān)鍵耐藥細(xì)菌和耐藥基因。

表3 雞糞中抗生素耐藥檢測(cè)結(jié)果（株）Table 3 Statistical results of antibiotic resistance test in poultry manure

表4 牛糞中抗生素耐藥檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（株）Table 4 Statistical results of antibiotic resistance test in cow manure

表5 豬糞中抗生素耐藥檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（株）Table 5 Statistical results of antibiotic resistance test in swine manure

2.4 多重耐藥菌的整合子構(gòu)成

整合子（Integrons）是耐藥基因傳播的重要參與者，它們常常能整合啟動(dòng)子與新耐藥基因，雖然耐藥整合子本身不具有移動(dòng)性，但其能與一系列耐藥基因的轉(zhuǎn)移和插入作用相關(guān)聯(lián)，對(duì)整合子結(jié)構(gòu)的解析有助于研究多重耐藥菌的進(jìn)化及轉(zhuǎn)移能力評(píng)估。筆者對(duì)獲得的85株多重耐藥菌進(jìn)行整合子檢測(cè)，結(jié)果表明，有69株菌含有Ⅰ類整合子基因，占81.2%；有50株菌含有Ⅱ類整合子基因，占58.8%。進(jìn)一步對(duì)整合子的基因盒進(jìn)行擴(kuò)增，總共獲得了11種基因盒（表6），片段長(zhǎng)度從0.8 kb到1.8 kb不等。在Ⅰ類整合子中有10個(gè)基因盒，其中分布較為廣泛的基因?yàn)榘被擒疹惸退幓騛adA2 36%（n=12/33）和磺胺類耐藥基因dfrA17 33%（n=11/33）兩種，在雞糞、牛糞和有機(jī)肥中均有檢出。在Ⅱ類整合子中，僅有sat2-dfrA1一種基因盒檢出，片段大小均為1.2 kb，這一結(jié)果與Yang等[13]研究相類似，說明Ⅱ類整合子基因盒較為保守。

3 結(jié)論

（1）規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場(chǎng)糞便中，四環(huán)素、恩諾沙星、磺胺甲惡唑和泰樂菌素4種抗生素的多重耐藥菌污染狀況（絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)數(shù)量）排序?yàn)殡u糞＞豬糞＞牛糞，糞源有機(jī)肥中可培養(yǎng)的多重耐藥菌的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)數(shù)量均有所下降，說明堆肥是一種控制多重耐藥細(xì)菌的有效手段。

表6 分離菌株的抗生素耐藥性及其與整合子的關(guān)系Table 6 Antibiotic resistance of isolated strains and their relationship to integrons

（2）規(guī)模化禽畜養(yǎng)殖糞便中多重耐藥菌主要集中在Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria3個(gè)門中，多重耐藥菌的優(yōu)勢(shì)屬為Escherichia、Corynebacteri?um、Kurthia；而有機(jī)肥樣品中多抗耐藥菌的優(yōu)勢(shì)屬與糞便中有所不同，為Staphylococcus和Glutamici?bacter。

（3）多重耐藥菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，3類養(yǎng)殖動(dòng)物糞便中的多重耐藥菌均對(duì)養(yǎng)殖常用抗生素如氯霉素類、氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類抗生素等都有著較高的耐藥性；而對(duì)氨基糖苷類和頭孢稀類抗生素，尤其是阿米卡星都有著較高的敏感率。

（4）通過對(duì)Ⅰ、Ⅱ類整合子基因盒的擴(kuò)增，明確了在養(yǎng)殖糞便和堆肥中廣泛存在的Ⅰ類整合子基因盒類型為aadA2和dfrA17，以及Ⅱ類整合子基因盒主要類型是sat-dfrA1。