孫嘉棟 孫曉鳳 李蘭 沈偉 程順峰

（青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，青島 266109）

我國是地方豬種質(zhì)資源最豐富的國家，1986版《中國豬品種志》中詳細介紹了48個中國地方豬種，并按自然地理分布將它們劃分為華北型、華中型、華南型、江海型、西南型和高原型［1］。隨著時間推移，我國發(fā)現(xiàn)的地方豬種數(shù)量不斷增加。2007年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織調(diào)查結(jié)果顯示，我國地方豬品種已達114個，占全球豬種資源的30%［2］。與國外高產(chǎn)豬種相比，我國地方豬種在粗飼料耐受、繁殖力、肉質(zhì)和適應力等方面更加優(yōu)秀，但由于其出生體重小、精飼料轉(zhuǎn)化力差、瘦肉率和屠宰率低、飼養(yǎng)周期長等特點，地方豬種在市場經(jīng)濟條件下極度缺乏生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益優(yōu)勢［3］。由于多年來片面追求高瘦肉率和生長速度，我國大量引進外來育成品種，對地方豬種進行雜交改良，使種豬和商品豬的規(guī)模生產(chǎn)基本被外來豬種壟斷［4］，致使部分地方豬種瀕危或滅絕，如項城豬（Sus scrofadomesticus Xiangcheng）、深縣豬（Sus scrofadomesticus Shenxian）、豪桿嘴型內(nèi)江豬（Sus scrofadomesticus Neijiang）和大普吉豬（Sus scrofadomesticus Puji）已被證實徹底滅絕［5］。地方豬種遺傳資源多樣性正遭受嚴重破壞，各種優(yōu)質(zhì)基因不斷流失。遺傳資源丟失會使品種內(nèi)遺傳變異減少，對我國生豬生產(chǎn)的可持續(xù)性產(chǎn)生嚴重影響，目前地方豬種遺傳多樣性的保護已迫在眉睫［6］?，F(xiàn)階段除原位保存、精液和胚胎冷凍保存、DNA文庫保種等方法外，體細胞庫保種也是保留種質(zhì)資源的有效手段［7］。目前，牛［8］、羊［9］和雞［10］等家畜家禽的體細胞庫已建立，但由于體細胞高度分化的特性及培養(yǎng)技術的限制，其目前只能通過體細胞核移植方式取得擴群效果［11］。相較于體細胞，干細胞具有向各種細胞分化的潛能，其多能性更強［12］，不僅可提高核移植的效率，得到更多健康仔豬［13］，還可分化成生殖細胞樣細胞［14］，使未來有望通過有性生殖的方式擴大瀕危豬種的種群數(shù)量。無論是從現(xiàn)有擴群途徑還是未來發(fā)展前景看，干細胞都比體細胞更具優(yōu)勢。因此建立地方豬種干細胞庫可以更加全面、更加有效的保護我國的地方豬種質(zhì)資源。

1 現(xiàn)有地方豬種種質(zhì)資源保護措施

原位保存法是以前最常用的活體保種法，即在地方豬種原產(chǎn)地建造良種基地，組建200頭以上且各代群體規(guī)?；疽恢碌谋７N群，每隔2.5年增加一代，以防止群體近交系數(shù)過大［15］。原位保存法以最直接的方式保留種質(zhì)資源，但由于所需的保種維持費用較高導致無法在全國推廣實施。其次，該方法需占用較大場地、組織管理工作復雜、受自然環(huán)境影響較大、優(yōu)秀群體和個體生理利用年限短等缺點也是該保種方式受限的原因［16］。而DNA文庫保種、精液冷凍保存、胚胎冷凍保存和體細胞冷凍保存等非活體保種技術也有其各自不足之處［17］。DNA文庫保種是將畜禽細胞內(nèi)的DNA片段通過連接質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化入菌的方法進行擴增保存。建立DNA文庫雖說可以有目的地保存控制優(yōu)良性狀的DNA片段，長久保存優(yōu)質(zhì)基因及遺傳資源，但卻無法復原原有動物種群，僅能簡單保存基因的DNA片段。其次，由于DNA保存過程中易降解的特性，動物大片段DNA文庫保存技術還需不斷提升［18］。精液和胚胎冷凍保存是將精液和胚胎在冷凍保護劑保護下，以最適降溫速率凍到-196℃的液氮或-269℃的液氦中。如有需要，便可借助人工授精或胚胎移植技術快速擴大種群，進行種質(zhì)創(chuàng)新，加快育種進度。然而，家豬的精液和胚胎冷凍保存與牛、馬等家畜相比一直存在技術差距。在精液冷凍方面，豬一次射精量大，約有200-300 mL，因此精液對外界溫度非常敏感，極其不耐凍。其次，豬是多胎動物，需要20-50億精子才能滿足1次配種，大劑量的豬精液冷凍保存給這項技術增加了困難［19］。在胚胎冷凍方面，由于豬胚胎的脂質(zhì)含量較高，冷凍保存難度大，使其胚胎冷凍保存技術相較于牛、羊等發(fā)展較為緩慢。不同發(fā)育階段的胚胎需使用不同的玻璃化冷凍條件，如何界定胚胎狀態(tài)并選出最佳冷凍條件也是其難點之一，且冷凍液選擇和去脂操作都有待進一步改善［20］。體細胞冷凍保存與精子胚胎冷凍技術相似，是將動物體細胞冷凍保存后，再通過體細胞核移植技術生產(chǎn)后代，由于體細胞比精子和胚胎更易從數(shù)量稀少的瀕危物種上收集，因此體細胞冷凍保存被認為是最有潛力保護瀕危物種的方法［21］。然而，目前生殖性克隆成功率低，尤其在豬上，只有1%-5%移植到代孕母豬的重構(gòu)胚胎能產(chǎn)生活的后代［22］，且大部分仔豬出生后表現(xiàn)異常［23］，使核移植效率進一步降低，極大限制該技術在保護種質(zhì)資源中的實際應用。

2 干細胞技術概述

干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的細胞，它不僅能分化成不同類型的細胞，以構(gòu)成機體各種復雜的組織器官，還可通過細胞分裂維持自身群體穩(wěn)定。根據(jù)其發(fā)育階段可分為胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）和成體干細胞（Adult stem cells，ASCs）［24］。1981年，Evans等 首次分離小鼠胚胎內(nèi)細胞團（Inner cell mass，ICM），并通過體外培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的胚胎干細胞系［25］。誘導多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）和胚胎干細胞有一定相似性，是由已分化的體細胞誘導重編程而來，具有多能性且能自我更新［26］。2006年，山 中 伸 彌 等 將OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC（OSKM）4個轉(zhuǎn)錄因子通過病毒載體轉(zhuǎn)到小鼠體細胞內(nèi)，首次得到類似胚胎干細胞的全新多能細胞［27］。2009年，周琪課題組和高紹榮課題組分別使用四倍體囊胚注射法獲得iPSCs來源小鼠，再次證明iPSCs具有與ESCs相似的多潛能特性［28-29］。此外，ASCs向生殖細胞分化也一直處于干細胞研究熱點中。ASCs在哺乳動物體內(nèi)大量存在，多能性相對ESCs較低，但大量研究證明ASCs具有轉(zhuǎn)分化為生殖細胞的能力，如骨髓干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞、皮膚干細胞和胰腺干細胞等均被證實可在體外轉(zhuǎn)分化為生殖細胞樣細胞［30］。

3 干細胞技術在地方豬種質(zhì)資源保護中的應用前景及可行性

人和小鼠的干細胞在體外已得到廣泛研究。豬作為人類較早馴化的動物之一，其主要臟器大小和生理結(jié)構(gòu)功能與人類非常相似［31］，所以豬干細胞研究一直是干細胞領域研究熱點，在小鼠干細胞大量前瞻性研究成果指引下，豬干細胞研究正逐步取得突破［32］。從大量已知報道中可知［33-36］，由于干細胞的全能性特質(zhì)，其在種質(zhì)資源保護中有廣泛的應用前景。

3.1 胚胎干細胞及誘導多能干細胞技術的應用

分化培養(yǎng)ESCs并獲得后代一直被全球科學家們所熱衷，在小鼠上已重復大量實驗，技術手段不斷完善。2012年，日本九州大學Hayashi等［37］成功將小鼠ESCs誘導成原始生殖細胞，而后將這些原始生殖細胞移植入成年小鼠體內(nèi)獲得正常卵母細胞。2016年，Hayashi等完全在體外實現(xiàn)ESCs分化為卵細胞，分化的卵細胞受精后可產(chǎn)生正常后代，這樣就擺脫需要成年個體的限制，且整個技術流程極為精 簡［38］。豬ESCs系 始 建 于1990年，Evans等［39］以豬植入前胚胎作為原始材料，發(fā)現(xiàn)當胚胎在小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層上生長時，可以無限期地保持在未分化狀態(tài)，并在達到高密度時自發(fā)分化成上皮、肌肉和神經(jīng)等各類細胞，他們依據(jù)這些現(xiàn)象初步描述了豬ESCs的特征。2016年，劉忠華課題組成功從體外培養(yǎng)5.5 d的囊胚中取出豬ESCs［40］。兩年內(nèi)，該細胞被傳代超過75次，克隆團的形態(tài)與人胚胎干細胞極為相似，且表達OCT4、SOX2和NANOG等經(jīng)典多能標志物。2019年，該課題組又通過KOLF培養(yǎng)體系獲得可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)40代以上且具有扁平形態(tài)和正常核型的豬ESCs，這些細胞不僅表達堿性磷酸酶活性，還表達OCT4、SOX2和NANOG等多能性標志物，并可在體內(nèi)形成含有三胚層的畸胎瘤，說明該細胞在體外和體內(nèi)都具有分化能力［41］。目前體外培養(yǎng)的豬ESCs和小鼠ESCs初始態(tài)（Na?ve）不同，傳代能力和多能性狀態(tài)不理想，更接近小鼠ESCs的始發(fā)態(tài)（Primed），且其仍無法嵌合到生殖系，只能被稱為“豬類胚胎干細胞”［42］。因此，豬ESCs的研究暫時告一段落，隨著iPSCs技術出現(xiàn)，豬iPSCs又繼續(xù)向前發(fā)展。

2009年，由iPSCs培養(yǎng)產(chǎn)生的成年小鼠在Boland實驗室中產(chǎn)生［43］。這讓研究者們看到這項技術的光明前景，iPSCs技術從此受到廣泛關注，并在幾年內(nèi)迅速發(fā)展［44］。在保護瀕危野生動物方面，由于取材方便、數(shù)量多且易于保存等優(yōu)點，iPSCs技術已被動物保護學家視為最有前景的技術［36］。自2009年起，科學家根據(jù)小鼠和人iPSCs的誘導系統(tǒng)及培養(yǎng)體系，開始嘗試建立豬iPSCs系。2009年，Ezashi等［45］使用慢病毒載體向胎豬成纖維細胞中導入hOCT4、hSOX2、hKLF4和hC-MYC四個轉(zhuǎn)錄因子，在小鼠胚胎成纖維細胞上培養(yǎng)22 d后得到豬iPSCs，該iPSCs具有正常核型，表達豬OCT4、NANOG和SOX2等多能標志物，有較高端粒酶活性，且在體內(nèi)外均有分化成三胚層的能力。2010年，West等［46］將6種 人 轉(zhuǎn) 錄 因 子（POU5F1、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28和C-MYC）導入豬間充質(zhì)細胞中，使其重編程為iPSCs。利用該iPSCs得到的嵌合體豬，80%都能嵌合到3個胚層的多種組織類型，嵌合率高。2012年，F(xiàn)ujishiro等［13］同樣將4個轉(zhuǎn)錄因子（OSKM）導入豬胚胎成纖維細胞中，通過在培養(yǎng)基中加入pLIF和forskolin兩種細胞因子，第一次培養(yǎng)出類似于小鼠ESCs初始態(tài)的豬iPSCs。2013年，賴良學課題組［47］通過讓豬iPSCs自發(fā)分化和加入組蛋白去乙?；敢种苿┑姆椒?，提高豬iPSCs作為供體細胞的核移植發(fā)育到囊胚的概率，且將這些iPSCs重構(gòu)胚胎移植到代孕母豬中，成功獲得健康克隆豬。2017年，韓建永課題組發(fā)現(xiàn)豬iPSCs向生殖細胞樣細胞誘導分化的方法，所得到的細胞不僅表達DAZL和VASA等生殖細胞標志基因，還可繼續(xù)分化成精原干細胞樣細胞［14］?，F(xiàn)階段，豬iPSCs的研究水平和深度已遠超豬ESCs，且豬成體細胞不像ESCs那樣稀少，取材更加便利，因此豬iPSCs比豬ESCs更適合應用到地方豬種質(zhì)資源的保護中。利用瀕危地方豬種成體細胞誘導出的iPSCs可分化成配子，放入地方豬種配子庫中繼續(xù)保存，又可結(jié)合核移植技術獲得新生仔豬，擴大瀕危地方豬種的種群數(shù)量。相比于其他保種方法，誘導多能干細胞技術在地方豬種質(zhì)資源保護方面可發(fā)揮更大用處。

3.2 多能干細胞作供體細胞的核移植技術的應用

豬體細胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）已被廣泛應用于轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)中，但該方法效率仍然很低。2009年，Oback等［48］發(fā)現(xiàn)利用早期細胞會導致SCNT后胚胎發(fā)育率增加，因此推測，多能干細胞可能會增加SCNT的效率。2012年，劉忠華課題組分別利用小鼠ESCs和胚胎成纖維細胞誘導而來的iPSCs作為供核細胞，發(fā)現(xiàn)供核細胞的細胞周期對核移植后胚胎發(fā)育過程有重要影響，把供核細胞阻滯在M期能大幅提高克隆胚胎發(fā)育率，最終得到克隆小鼠并能產(chǎn)生后代［49］。此類實驗在豬上也有涉及。2017年，Secher等［50］發(fā)現(xiàn)用豬多能干細胞代替體細胞進行核移植，胚胎發(fā)育到囊胚的個數(shù)增加，更有利于提高核移植效率，最終得到克隆豬的數(shù)量和質(zhì)量都有所增加。由此可見，將干細胞作為核移植的供體細胞，會比普通體細胞核移植產(chǎn)生更好的效果，因為干細胞比體細胞更接近囊胚中的表觀遺傳狀態(tài)，所需的重編程更少［50］。干細胞作為供體細胞的核移植有望成為拯救瀕危地方豬種最有效的方法，利用該技術可以得到更多優(yōu)質(zhì)仔豬，使地方豬種種群數(shù)量進一步擴大，遺傳資源得到保存。

3.3 成體干細胞誘導分化技術的應用

ASCs中，骨髓干細胞、皮膚干細胞、胰腺干細胞以及人的羊水干細胞都已被證實可向配子分化［51］。由于皮膚干細胞數(shù)量豐富，取材便利，因此皮膚干細胞向配子分化的研究備受關注。2001年，Toma等［52］將小鼠皮膚分離培養(yǎng)后得到一種具有多向分化能力的ASCs，其在體外條件下能向神經(jīng)細胞、脂肪細胞和平滑肌細胞等分化。2004年，Dyce等［53］第一次從胎豬上分離出皮膚來源干細胞，該細胞表達神經(jīng)祖細胞標記基因Nestin，以及多能性相關基因OCT4和STAT3，并能誘導分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和脂肪細胞樣細胞，2006年，Dyce等［54］又使用豬卵泡液成功誘導胎豬皮膚干細胞分化為具有透明帶樣結(jié)構(gòu)的卵母細胞，誘導形成的卵母細胞表達DAZL和VASA等生殖細胞標記基因，且能分泌卵巢類固醇激素，并可孤雌激活形成囊胚。2011年，沈偉與Dyce分析由胎豬皮膚干細胞分化的卵母細胞樣細胞時發(fā)現(xiàn)，一部分細胞處于減數(shù)分裂I期，且在H19基因5'端的DMR1區(qū)域與體內(nèi)卵母細胞有相似的甲基化模式［55］。同年，Song等［56］從胎豬皮膚和脂肪中分離出ASCs，并用豬卵泡液誘導其分化成卵母細胞樣細胞，該細胞在形態(tài)、堿性磷酸酶活性、細胞周期狀態(tài)和各種細胞表面標記物的表達方面均與體內(nèi)卵母細胞有相似的特征。由以上研究看出，豬皮膚來源干細胞向原始生殖細胞和卵母細胞分化是可行的。精原干細胞（Spermatogonia stem cells，SSCs）作為雄性體內(nèi)唯一可將遺傳物質(zhì)傳遞給后代的細胞，也是一種ASCs［57］。2011年，Sato等［58］將小鼠SSCs在離體的培養(yǎng)條件下分化為可育精子。2018年，盧克煥課題組在基礎培養(yǎng)基中加入敲除血清替代品（Knockout serum replacement，KSR）和誘導因子，將豬SSCs在體外條件下培養(yǎng)至減數(shù)分裂后期，并表達STRA8和SCP3等減數(shù)分裂標志物，距離得到成熟精子僅一步之遙［59］。在地方豬種干細胞庫中，如能收集瀕危地方豬種的ASCs，即可通過分化獲得大量配子，進而達到拯救瀕危地方豬種的目的。同時，配子發(fā)生過程中的減數(shù)分裂遺傳重組可豐富物種進化過程中的遺傳多樣性，相較于體細胞核移植產(chǎn)生的單一基因型后代，由配子受精產(chǎn)生的仔豬更有利于瀕危種群的繁衍。

4 總結(jié)與展望

豬ESCs、iPSCs和ASCs向配子分化技術及核移植技術已處于可應用階段，我國學者已證實，通過干細胞與核移植技術相結(jié)合得到健康仔豬。雖然目前豬干細胞分化得到的配子樣細胞還不具備受精發(fā)育成新個體的能力，但干細胞技術作為地方豬種質(zhì)資源保護的新手段，為更好地保留我國瀕臨滅絕的地方豬種的優(yōu)質(zhì)生物資源提供了新思路?，F(xiàn)階段，須加快建立地方豬種質(zhì)資源干細胞庫，豐富對地方豬種遺傳資源的保護手段。干細胞庫可與配子庫、胚胎庫、基因庫等一起，形成多層次、多角度，全方位的遺傳資源保存體系。