杜曉果，楊蕊，陳新娜，王穎，李紅真

(北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100191)

預(yù)期卵巢低反應(yīng)(POR)患者無論年輕或高齡(POSEIDON G3或G4)大多表現(xiàn)為月經(jīng)周期縮短或排卵障礙(有卵泡發(fā)育但不排卵也不黃素化，表現(xiàn)為濾泡囊腫)，月經(jīng)第2天往往表現(xiàn)為卵泡已優(yōu)勢化(卵泡大小不一)或有大的卵巢濾泡囊腫。原本計(jì)劃短方案或拮抗劑方案的患者就可能因此放棄，但國內(nèi)大多數(shù)生殖醫(yī)生會選擇口服避孕藥(OCP)一個周期(21 d)，撤退出血后的第2天再按原方案進(jìn)行控制性卵巢刺激(COS)。2017年的一項(xiàng)系統(tǒng)回顧顯示，拮抗劑方案中OCP預(yù)處理與較低的持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率相關(guān)[1]。最近一項(xiàng)Meta分析顯示，PCOS患者輔助生殖技術(shù)(ART)助孕前OCP預(yù)處理與不利的妊娠結(jié)局有關(guān)，尤其在拮抗劑方案中[2]。歐美用拮抗劑方案前為規(guī)劃周期常用OCP，不限定應(yīng)用的時間長短，而且強(qiáng)調(diào)要有washout(停藥時間)5 d，有利于新鮮周期的結(jié)局[3-5]。但是關(guān)于OCP預(yù)處理對促排卵及臨床妊娠率的影響，臨床上仍有較大爭議，主要考慮可能與OCP應(yīng)用人群、促排卵方案、Gn啟動時機(jī)及預(yù)處理時間不同有關(guān)[5-8]。有研究顯示月經(jīng)規(guī)律、內(nèi)分泌正常的女性于激動劑長方案前OCP用藥時間越長，降調(diào)后激素水平越低，優(yōu)勢卵泡數(shù)減少，建議應(yīng)用一個周期，不推薦長時間用藥[9]。而Pan等[10]研究顯示PCOS患者連續(xù)OCP預(yù)處理≥3個周期可明顯改善臨床結(jié)局，而OCP預(yù)處理≤2個周期并未明顯改善臨床結(jié)局。關(guān)于POR患者OCP預(yù)處理時間對妊娠結(jié)局的影響尚未見報道。鑒于OCP應(yīng)用7～16 d就足以使卵泡同步化和生理性囊腫消失，本文部分研究者自2016年起嘗試對預(yù)期POR患者進(jìn)行個體化的OCP預(yù)處理(用藥時間7～16 d，停藥時間5 d)，為觀察效果，我們對POSEIDON預(yù)期POR患者進(jìn)行OCP預(yù)處理的超短GnRH激動劑聯(lián)合拮抗劑方案中IVF的臨床資料進(jìn)行了回顧性分析，探討OCP預(yù)處理時間對臨床結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象和分組

回顧性分析2016年1月1日至2018年6月30日期間就診我院生殖中心、診斷為POR行IVF/ICSI-ET患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合POSEIDON預(yù)期低預(yù)后的POR患者[11](即AMH<1.2 ng/ml，AFC<5)；促排卵方案為超短GnRH激動劑(GnRH-a)聯(lián)合拮抗劑(GnRH-ant)方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有明確影響胚胎著床的其他因素如重度宮腔粘連、輸卵管積水、粘膜下肌瘤等；染色體異常或復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)或者胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)的患者；合并未控制的內(nèi)分泌疾病，如糖尿病、高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常等。

選擇其中應(yīng)用OCP預(yù)處理(7～30 d)后應(yīng)用超短GnRH激動劑聯(lián)合拮抗劑方案的167個IVF周期，按照OCP預(yù)處理時間不同分為A組(OCP預(yù)處理時間≤16 d，n=107，且均在停藥5 d后啟動Gn)和B組(OCP預(yù)處理時間>16 d，n=60，其中用藥21 d的有30個周期，停藥后陰道出血第2天啟動Gn)。比較兩組患者的一般資料、促排卵周期指標(biāo)及臨床妊娠結(jié)局。

二、診療回顧

1.OCP預(yù)處理：自月經(jīng)第2～3天(月經(jīng)規(guī)律者)或者超聲或血激素水平提示卵巢及子宮內(nèi)膜處于基礎(chǔ)狀態(tài)(月經(jīng)不規(guī)律者)時，口服媽富隆(每片含0.15 mg去氧孕烯和0.03 mg炔雌醇，21片/盒，歐加農(nóng)，荷蘭)或達(dá)英-35(每片含2 mg醋酸環(huán)丙孕酮和35 μg炔雌醇，21片/盒，拜耳，德國)7～30 d。

2.超短GnRH-a聯(lián)合GnRH-ant方案：OCP停藥5 d后或者OCP撤退出血第2天開始皮下注射GnRH-a(曲普瑞林，益普生，法國)0.1 mg/d，連用3 d；次日開始使用促性腺激素(Gn)150～450 U/d促排卵，Gn包括注射用重組人FSH(rFSH，默克雪蘭諾，瑞士；或rFSHβ注射液，歐加農(nóng)，荷蘭)、注射用尿FSH(尿源性FSH，Institut Biochimique SA，瑞士)及尿源性人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG，珠海麗珠制藥)、注射用高純度尿促性素(賀美奇，輝凌，德國)；Gn應(yīng)用4 d后開始B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，并適時監(jiān)測血清LH、E2、P水平，當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑>12～14 mm和/或血清E2水平在800～1 500 pmol/L時加用GnRH-ant(注射用醋酸西曲瑞克，默克雪蘭諾，瑞士；思則凱，Baxter Oncology，德國)0.25 mg/d，直到扳機(jī)日。當(dāng)有1～3個主導(dǎo)卵泡達(dá)1.8 cm時，給予重組HCG(rHCG，默克雪蘭諾，瑞士)0.25 mg或者聯(lián)合扳機(jī)(曲普瑞林0.2 mg+rHCG 0.25 mg)。

3.取卵、受精及胚胎移植：兩組患者均在扳機(jī)后36～38 h行經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下取卵術(shù)。取卵后根據(jù)精子質(zhì)量及既往受精情況，選擇受精方式。黃體支持方案為自取卵日起予黃體酮凝膠(默克雪蘭諾，瑞士)90 mg/d。取卵術(shù)后3 d或5 d，行胚胎移植術(shù)。因患者自身原因未能行鮮胚移植或者有剩余胚胎者，均行玻璃化冷凍保存，擇期行凍融胚胎移植(FET)。

4.評價指標(biāo)：可利用胚胎為受精第3天胚胎卵裂球數(shù)4～8個、分級為2級及以上的胚胎；優(yōu)質(zhì)胚胎為胚胎卵裂球數(shù)6～8個、分級為2級及以上的胚胎。胚胎移植術(shù)后14 d及21 d分別進(jìn)行血清HCG 檢查，妊娠者移植術(shù)后28～30 d行陰道B超檢查，可探及宮內(nèi)妊娠囊或臨床明確診斷宮外孕者為臨床妊娠。

三、觀察分析指標(biāo)

主要觀察指標(biāo)為臨床妊娠率。其他觀察指標(biāo)包括一般資料(年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、基礎(chǔ)FSH、AFC、AMH)，Gn用藥天數(shù)及劑量，HCG日血清E2、LH、P水平，獲得卵母細(xì)胞數(shù)，受精率、卵裂率、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)(率)，移植周期胚胎著床率、流產(chǎn)率及周期取消率。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

兩組患者年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH及AMH水平、IVF周期數(shù)、原發(fā)不孕和排卵障礙的比例均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，A組患者AFC顯著少于B組(P=0.028)(表1)。

表1 患者一般資料比較[(-±s)，%]

注：與B組比較，*P<0.05

二、患者COS及實(shí)驗(yàn)室情況比較

A組Gn起始劑量、Gn總天數(shù)及Gn總量均顯著低于B組(P<0.05)；兩組間HCG日血清雌激素、LH、P水平及子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、ICSI率、受精率、卵裂率、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)胚(數(shù))率、移植周期數(shù)、移植胚胎數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 COS及IVF治療相關(guān)參數(shù)比較[(-±s)，%]

注：與B組比較，*P<0.05

三、胚胎移植及臨床結(jié)局比較

A、B兩組周期取消率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；A組鮮胚移植周期著床率和臨床妊娠率均顯著高于B組(P<0.05)，而兩組間FET周期的著床率和臨床妊娠率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩組間早期流產(chǎn)率在鮮胚移植周期和FET周期均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

四、影響臨床妊娠因素的Logistic回歸分析

納入可能影響臨床妊娠的相關(guān)因素：年齡、BMI、基礎(chǔ)AMH、AFC、OCP預(yù)處理方案(組別)、Gn起始劑量、Gn天數(shù)、獲卵數(shù)、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)胚數(shù)、移植周期類型及囊胚移植周期數(shù)進(jìn)行多因素回歸分析。采用進(jìn)入法，結(jié)果顯示組別在模型中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表3 胚胎移植及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

注：與B組比較，*P<0.05；#周期取消包括COS失敗、未取到卵、未受精及無可移植胚胎周期

表4 影響妊娠因素的Logistic回歸分析

注：*P<0.05；#移植周期類型為鮮胚移植或者FET

討 論

POR的助孕治療是輔助生殖實(shí)踐中一個引人注目的問題。2011年ESHRE的POR診斷標(biāo)準(zhǔn)異質(zhì)性太大，不利于臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)和進(jìn)行臨床研究[12]。2016年P(guān)OSEIDON工作組將低預(yù)后人群按年齡和卵巢儲備及既往COS周期中卵巢的不同反應(yīng)分為4組，其中預(yù)期低反應(yīng)(AMH<1.2 ng/ml，AFC<5)人群按年齡分為G3(年齡≤35歲)和G4(年齡>35歲)。自GnRH-a和GnRH-ant廣泛應(yīng)用于臨床以來，除經(jīng)典的促排卵方案外，還有多種改良的促排卵方案以期提高POR患者臨床結(jié)局。2004年Berger等[13]首次提出將GnRH-a和GnRH-ant聯(lián)合(Agonist-Antagonist Protocol，AAP)作為一種新的方案應(yīng)用于POR患者，聯(lián)合二者的優(yōu)勢作用，并使其不利作用最小化。AAP方案主要包括OCP預(yù)處理及超短GnRH激動劑flare-up與拮抗劑組合，月經(jīng)周期第2～5天開始應(yīng)用OCP至少7 d，停OCP后3 d再連用3 d小劑量GnRH-a，隨后2 d啟動Gn，根據(jù)卵泡發(fā)育情況適時添加GnRH-ant。Orvieto等[14]研究顯示該方案可提高POR患者的獲卵數(shù)及移植胚胎數(shù)，獲得滿意的臨床結(jié)局。本研究采用超短GnRH-a與GnRH-ant聯(lián)合方案，利用GnRH-a短暫的flare-up效應(yīng)，產(chǎn)生內(nèi)源性FSH、LH，有利于卵泡募集，減少Gn用量，適時添加GnRH-ant防止早發(fā)LH峰及提前排卵。因?yàn)槭荊nRH-a超短方案(僅用3 d)，扳機(jī)日可再用GnRH-a和HCG聯(lián)合扳機(jī)誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，可增加卵泡的輸出率，改善卵母細(xì)胞的成熟度，故此方案充分利用了聯(lián)合GnRH激動劑與拮抗劑優(yōu)勢，在預(yù)期POR患者中獲得了較好的臨床結(jié)局。

為使預(yù)期POR患者用超短激動劑時卵泡發(fā)育更同步以及更好地規(guī)劃周期，OCP的預(yù)治療非常關(guān)鍵。OCP預(yù)處理通過抑制POR患者黃體期提前升高的FSH，使得在啟動Gn時募集的卵泡更均一，卵泡發(fā)育更同步，同時避免卵巢黃素囊腫的形成。已有研究顯示OCP預(yù)處理可以抑制GnRH-a治療前的FSH水平，但并不影響卵泡對GnRH-a的flare up反應(yīng)[15]。

關(guān)于OCP預(yù)處理對促排卵的影響，文獻(xiàn)報道主要為增加促排卵時間及Gn總量，增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-6，8]。Duvan等[16]研究顯示，在POR人群行flare up方案，OCP預(yù)處理21 d，停藥2 d行GnRH-a flare up，第3天啟動Gn，OCP組促排卵時間及Gn用量高于對照組；也有文獻(xiàn)報道，POR患者GnRH-ant方案前OCP預(yù)處理可獲得與GnRH-a相似的促排卵效果，而Gn用量少，促排卵時間短[17-19]。分析文獻(xiàn)報道結(jié)果不一致的主要原因可能與OCP預(yù)處理后停藥間隔及Gn啟動時機(jī)有關(guān)。已有研究顯示OCP預(yù)治療停藥5 d后FSH可恢復(fù)至正常基礎(chǔ)水平，預(yù)處理后Gn啟動時機(jī)是權(quán)衡募集卵泡均一化和Gn用量的重要影響因素[7]。近期在贈卵人群的一項(xiàng)研究顯示，OCP預(yù)處理后，與停藥5 d啟動Gn相比，停藥間隔延至7 d可明顯降低Gn時間、總量及費(fèi)用，而獲卵數(shù)及MII卵數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[20]。本研究中A組OCP的預(yù)治療均在啟動Gn前5 d停藥，與標(biāo)準(zhǔn)GnRH-ant方案不同，本研究所用促排卵方案利用GnRH-a短暫的flare-up效應(yīng)，產(chǎn)生內(nèi)源性FSH、LH，有利于卵泡募集，減少Gn用量。我們前期的研究比較POR患者AAP方案前不同預(yù)處理(OCP預(yù)處理、補(bǔ)佳樂預(yù)處理和未處理組)對妊娠結(jié)局的影響，數(shù)據(jù)顯示，與未處理組相比，OCP或補(bǔ)佳樂預(yù)處理未明顯增加Gn用量(待發(fā)表)。本研究中兩組間獲卵數(shù)、受精率、卵裂率及優(yōu)胚率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而，OCP預(yù)處理>16 d組促排卵時間及Gn用量明顯增加。本研究結(jié)果提示OCP預(yù)處理短于16 d且停藥5 d已足夠抑制POR患者FSH的升高，達(dá)到募集卵泡均一性目的，同時避免對下丘腦垂體卵巢軸的過度抑制，因此延長OCP預(yù)處理時間并不能增加獲卵數(shù)及改善促排卵效果，且增加促排卵時間及Gn用量，增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。不注意停藥間隔期，只是在停藥后陰道出血的第2天(出血時間因人而異，有人會一停藥甚至還沒停藥就有陰道出血)啟動Gn，會導(dǎo)致不穩(wěn)定的促排卵效果，甚至影響子宮內(nèi)膜容受性，影響新鮮周期的結(jié)局。

OCP預(yù)處理對妊娠結(jié)局的影響仍無定論，尚缺乏明確的共識，可能與不同的人群、促排卵方案、Gn啟動時機(jī)及OCP用藥方案有關(guān)[5-6]。Wei等[21]研究顯示PCOS患者GnRH-ant周期前OCP用藥21～25 d誘導(dǎo)月經(jīng)與較低的臨床妊娠率及活產(chǎn)率有關(guān)。而對月經(jīng)規(guī)律的正常女性人群，有研究顯示GnRH-ant方案前OCP預(yù)處理對臨床結(jié)局有負(fù)面影響[6]；另有研究顯示，GnRH-ant周期前OCP預(yù)處理12～16 d，停藥5 d后啟動Gn，與標(biāo)準(zhǔn)長方案或者GnRH-ant方案前雌激素預(yù)處理組相比，臨床結(jié)局無明顯差異[3，22]。西班牙IVI中心研究數(shù)據(jù)顯示年輕健康女性GnRH-ant方案前OCP預(yù)處理不超過12～16 d，停藥5 d后啟動Gn不會影響胚胎植入相關(guān)的子宮內(nèi)膜容受性基因表達(dá)[4]。因此，OCP預(yù)治療時間及啟動Gn時機(jī)均有可能影響促排卵效果及臨床結(jié)局。最近的一項(xiàng)系統(tǒng)回顧顯示POR患者GnRH-ant方案前OCP預(yù)處理與未處理組活產(chǎn)率和持續(xù)妊娠率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[1]，考慮可能與納入研究的OCP預(yù)處理時間不同有關(guān)。本研究中OCP的預(yù)治療均在啟動Gn前5 d停藥，OCP用藥時間>16 d組鮮胚移植周期的著床率及臨床妊娠率明顯低于用藥時間≤16天組，而兩組間凍融胚胎移植周期的著床率及臨床妊娠率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測OCP預(yù)處理時間>16 d可能通過影響鮮胚移植周期的子宮內(nèi)膜容受性來降低臨床妊娠率，因此臨床上為了不影響鮮胚移植周期的妊娠率，且降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，建議OCP預(yù)處理不超過16 d。

本研究的局限性：由于受回顧性研究影響，且因臨床個體化處理所致，兩組Gn啟動劑量不統(tǒng)一，Gn起始劑量波動偏大有可能會對結(jié)果產(chǎn)生影響；同時，整體樣本量偏小，尤其是解凍周期的樣本量更小，有可能對結(jié)果產(chǎn)生偏倚。另外，本研究中OCP類型為兩種(媽富隆或達(dá)英-35，均為低劑量OCP)，且預(yù)處理時間波動較大，可能對結(jié)果產(chǎn)生影響，最佳的預(yù)處理時間仍需進(jìn)一步研究。

總之，本研究顯示，POSEIDON預(yù)期POR患者超短GnRH-a聯(lián)合GnRH-ant方案前OCP預(yù)處理>16 d，鮮胚移植周期的妊娠率明顯下降，且增加卵巢刺激時間及Gn用量，增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但是并不影響凍融胚胎移植周期的妊娠率。為了不影響鮮胚移植周期的妊娠率，且降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，建議OCP預(yù)處理不超過16 d，啟動Gn前停藥5 d。由于本研究的上述局限性，需要進(jìn)一步的前瞻性隨機(jī)對照試驗(yàn)來驗(yàn)證本文所報告的結(jié)果。